【摘 要】
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目的:构建稳定表达人PD-1胞外段蛋白的细胞系（L02-PD-1N）,以该细胞为筛选靶细胞,利用Cell-SELEX技术筛选出针对PD-1胞外段蛋白的高亲和性及特异性适配体。方法:通过分子克隆技术构建含有人PD-1胞外段基因的重组质粒,转染L02细胞并用G418进行抗性筛选,筛选出能特异性表达PD-1胞外段蛋白的L02-PD-1N细胞,并通过蛋白印迹试验和流式细胞术鉴定;设计并构建一个ss DNA
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目的:构建稳定表达人PD-1胞外段蛋白的细胞系（L02-PD-1N）,以该细胞为筛选靶细胞,利用Cell-SELEX技术筛选出针对PD-1胞外段蛋白的高亲和性及特异性适配体。方法:通过分子克隆技术构建含有人PD-1胞外段基因的重组质粒,转染L02细胞并用G418进行抗性筛选,筛选出能特异性表达PD-1胞外段蛋白的L02-PD-1N细胞,并通过蛋白印迹试验和流式细胞术鉴定;设计并构建一个ss DNA寡核苷酸文库,核心部分为带有30个随机碱基的序列,前后两端为固定的引物序列;以L02-PD-1N细胞为正筛细胞,以不表达PD-1胞外段蛋白的同系细胞L02为反筛细胞,利用Cell-SELEX技术筛选针对PD-1胞外段蛋白的特异性适配体,经过12轮SELEX筛选后,对筛选文库进行PCR扩增、质粒转染、单克隆挑选及测序获得适配体候选对象;利用化学合成方法在适配体的5,端分别用生物素和FITC基团标记,通过ELONA及流式细胞术检测适配体与PD-1N蛋白和L02-PD-1N细胞的结合能力,选择出高亲和力的特异性适配体,通过流式细胞术测定适配体的解离常数Kd值,鉴定出特异性与亲和力最佳的适配体,并利用细胞免疫荧光技术进行验证;随后,利用组织免疫荧光技术检测适配体与结核及肿瘤患者组织中T细胞表面PD-1的结合。结果:构建PD-1胞外段基因重组质粒并成功转染L02细胞,筛选出特异性表达PD-1胞外段蛋白的稳定表达的L02-PD-1N细胞;经过12轮SELEX筛选成功获得26条候选适配体序列,通过ELONA和流式细胞术发现P13适配体的特异性和亲和力最佳,其Kd值89.5±24.4 n M,处于nmol级别;利用细胞免疫荧光技术发现其可特异性结合在L02-PD-1N细胞膜表面,而不结合L02细胞;组织免疫荧光试验表明适配体P13可与结核及肿瘤组织中T细胞表面PD-1分子结合。结论:我们成功制备了表达PD-1胞外段蛋白的L02-PD-1N细胞,以该细胞作为靶细胞,通过Cell-SELEX技术筛选的适配体P13可以特异性识别PD-1胞外段蛋白。利用组织免疫荧光技术发现适配体P13能够结合结核病及肿瘤患者组织中T细胞表面的PD-1分子,初步表明该适配体具有疾病诊断及治疗的应用潜能,这可能为结核病和肿瘤的控制提供了新的途径。
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