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目的: 研究显示,乙酰肝素酶(HPA)能促进胃癌侵袭和转移。但其促进胃癌侵袭、转移的机制尚未明确。上皮一间质转化(EMT)在肿瘤侵袭和转移过程中起重要作用。为此,本实验在前期研究基础上,探讨乙酰肝素酶是否通过诱导人胃癌MGC803细胞发生EMT促进胃癌细胞侵袭和转移。 方法: 1、在无内源性表达HPA的人胃癌细胞MGC803中转染载体pcDNA3.1(HPA)、pcDNA3.1(GFP)、pcDNA3.1(+),荧光显微镜下观察转染效率,Western Blot技术检测转染后,目标蛋白表达情况。 2、相差倒置显微镜观察人胃癌细胞MGC803转染pcDNA3.1(HPA)后的细胞形态学变化。 3、在激光扫描共聚焦显微镜下直接观察观察人胃癌细胞MGC803转染pcDNA3.1(HPA)后β-catenin表达变化。 4、Western Blot技术检测人胃癌细胞MGC803转染pcDNA3.1(HPA)后细胞中上皮标志物E-cadherin和间质标志物N-cadherin、Vimentin蛋白表达的变化。 5、细胞划痕实验观察观察人胃癌细胞MGC803转染pcDNA3.1(HPA)后细胞迁移能力变化。 6、Transwell实验观察人胃癌细胞MGC803转染pcDNA3.1(HPA)后细胞侵袭能力变化。 7、利用免疫组化方法检测人胃癌组织中不同的病理参数间乙酰肝素酶、上皮标志物和间质标志物表达差异,观察各病理参数下的胃癌细胞上述蛋白表达情况及关系,并进行统计学分析,阐明它们之间的相关性,进一步验证体外细胞水平得到结果。 结果: 1、在无内源性表达HPA的人胃癌细胞MGC803中转染载体pcDNA3.1(HPA)、pcDNA3.1(GFP)、pcDNA3.1(+),转染后荧光显微镜下观察绿色荧光,可见转染pcDNA3.1(GFP)的细胞的转染效率约为40%-50%,Western Blot技术检测转染后三组人胃癌细胞MGC803以及对照组(Control)中HPA含量,转染pcDNA3.1(HPA)的人胃癌细胞MGC803 HPA的表达高于其他组,差异有统计学意义(p<0.05)。 2、倒置显微镜下观察,人胃癌细胞MGC803过表达乙酰肝素酶重组蛋白后形态变梭。 3、通过激光共聚焦扫描显微镜观察,随着转染时间的推移,β-catenin发生核转位现象,表达位置由胞膜向胞浆、胞核转移。 4、Western Blot技术检测人胃癌细胞MGC803转染前后蛋白含量变化,上皮标志物E-cadherin下降,结果具有统计学意义(p<0.05),间质标志物N-cadherin、Vimentin增高,结果具有统计学意义(p<0.05)。 5、细胞划痕实验证明,转染后MGC803细胞的迁移能力增强,转染前后相比较具有统计学意义(p<0.05)。 6、Transwell实验证明,转染后人胃癌细胞MGC803的侵袭能力增强,转染前后相比较具有统计学意义(p<0.05)。 7、免疫组化测定胃癌组织中蛋白量变化:低分化胃癌、中分化胃癌与高分化胃癌中HPA以及上皮标志物E-cadherin,间质标志物Vimentin、N-cadherin的表达存在差异(p<0.05),结果具有统计学意义。侵袭深度不同HPA以及上皮标志物E-cadherin,间质标志物Vimentin、N-cadherin的表达具有差异性(p<0.05),结果具有统计学意义。有淋巴结转移与无淋巴结转移的肿瘤中HPA以及上皮标志物E-cadherin,间质标志物Vimentin、N-cadherin的表达具有差异性(p<0.05),结果具有统计学意义。不同位置的胃癌的HPA以及上皮标志物E-cadherin,间质细胞标志物Vimentin、N-cadherin的表达也存在差异(p<0.05)。HPA以及上皮标志物E-cadherin,间质细胞标志物Vimentin、N-cadherin的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小无明显相关(p>0.05)。 结论: 1、乙酰肝素酶可诱导人胃癌细胞发生EMT。 2、乙酰肝素酶诱导人胃癌细胞发生EMT可促进胃癌的侵袭、转移。