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锁阳(CynomoriumsongaricumRupr.)是生长于干旱荒漠地区的全寄生高等植物,其肉质茎为常用补益中药,具有多种生物活性。随着人们保健意识的增强,锁阳的综合开发利用及相关保健产品的开发越来越受到人们的重视。然而,锁阳的主要有效成分及其药理活性尚未明确。目前,锁阳的研究主要集中于小分子化合物的分离鉴定及粗提物的药理活性研究,对于锁阳中含量极其丰富的以原花青素为代表的多酚类化合物的研究较少,而原花青素是具有极强开发价值的植物天然产物。因此深入研究锁阳原花青素等多酚类化合物,可为阐明锁阳的主要有效成分提供佐证,同时为锁阳的开发利用提供理论支持。本文从锁阳抗氧化活性物质的分离鉴定入手,采用体外自由基清除实验考察锁阳的抗氧化活性,并应用高效液相色谱质谱联用仪(HPLC-MS)和高速逆流色谱法(HSCCC)分离鉴定了锁阳中主要的多酚类抗氧化活性物质。在此基础上,应用柱色谱法分离纯化了锁阳原花青素类化合物,并应用光谱学和化学分析手段对其结构进行鉴定,同时,考察了锁阳原花青素对耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)的抗菌活性。实验结果如下:
1.本文应用ABTS法和DPPH法考察了锁阳丙酮粗提物及其萃取部分的抗氧化活性,同时研究了粗提物及其萃取部分的多酚含量。结果表明,锁阳含有大量的多酚类物质(264.0mgGAE/g),具有较强的清除自由基能力。其中,乙酸乙酯萃取物多酚含量最高为484.8mgGAE/g,乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的自由基清除活性均显著强于抗坏血酸和维生素E。
2.HPLC-MS分析锁阳乙酸乙酯萃取物中含的多酚类化合物,证实主要为儿茶素类和原花色素化合物,包括原花青素二聚体、三聚体及其没食子酸酯。应用HSCCC分离得到三种活性较强的小分子多酚类化合物,分别是原儿茶酸(1)、没食子酸(2)和(+)-茶素(3)。(+)-儿茶素的得率最高,约为69.85mg/g,是锁阳中主要的小分子多酚类化合物。
3.应用柱色谱法分离得到锁阳中的9种低聚原花青素单体化合物及1种锁阳多聚原花青素(CS-PP-A)混合物。综合应用MS、CD、NMR光谱学和化学降解手段鉴定单体化合物的化学结构,分别为(+)-儿茶素(3)、(-)-表儿茶素(4)、原花青素B1(5)、原花青素B3(6)、catechin-(6-8)-catechin(7)、catechin-(6-6)-catechin(8)、epicatechin-(4β-8)-epicatechin-(4β-8)-catechin(9)、epicatechin-(4β-6)-epicatechin-(4β-8)-catechin(10)和arecatanninA1(11),其中6-11为首次从锁阳中提取得到。
4.锁阳提取物及单体化合物的抗MRSA活性初步研究结果显示,锁阳丙酮粗提物具有一定的的抗MRSA活性,MIC值为512μg/ml,抑制浓度为64μg/ml;Diaion各流份中,40%和60%甲醇洗脱部分的MIC值最低(128μg/ml),抑制浓度为16μg/ml,表明该流份在较低浓度时即对MRSA的生长产生影响,浓度为128μg/ml时完全抑制MRSA的生长。虽然各原花青素低聚物的抑制浓度有所不同,但它们的MIC值均大于1024μg/ml,表明锁阳原花青素低聚物对MRSA的抑制作用较低。锁阳多聚原花青素CS-PP-A的MIC值为64μg/ml,抑制浓度为8μg/ml。证明CS-PP-A具有较强的抗:MRSA活性。
5.本文首次应用酸催化降解法、凝胶过滤色谱法(GPC)和13CNMR法对锁阳多聚原花青素(CS-PP-A)的化学结构进行分析和鉴定,阐明CS-PP-A的末端组成单元为儿茶素和表儿茶素,比例为4.5:1;延伸单元主要为表儿茶素,并有少量儿茶素和表儿茶素没食子酸酯,比例为11:1:1。其平均分子量为4400,为B型原花青素十四聚体。
6.应用柱色谱法对CS-PP-A的降解产物进行分离纯化,采用MS、CD、1HNMR、13CNMR和HMBC等方法鉴定其结构,得到2种已知的主要产物epicatechin-(4β-2)-phloroglucinol(12)、epicatechin-3-O-gallate-(4β-2)-phloroglucinol(13)和2种新的化合物cynomoriitannin-phloroglucinolA(14)和cynomoriitannin-phloroglucinolB(15)