论文部分内容阅读
目的胃癌是世界范围内最常发生的恶性肿瘤之一,在亚洲国家是肿瘤死亡的主要原因。多数患者在诊断时已经是进展期或发生转移,5年生存率只有10%-15%。化疗是治疗晚期胃癌的主要手段。尽管化疗药物的应用使晚期病人的生存期有所延长,但中位总生存时间很难超过12个月。生物治疗有选择性治疗恶性肿瘤的潜力,因此具有很好的治疗前景。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）是肿瘤坏死因子家族的成员之一。在体外研究中,TRAIL诱导许多肿瘤细胞的凋亡,对多数正常细胞没有毒性。但胃癌细胞对TRAIL相对不敏感。TRAIL诱导的凋亡信号传递需要结合死亡受体4（DR4）和死亡受体5（DR5）。TRAIL与DR4和DR5结合后导致受体聚集,并募集Fas相关蛋白死亡结构域（FADD）和前caspase-8、前caspase-10,共同形成死亡诱导信号复合物（DISC）。DISC的形成促发下游效应物caspase并诱导凋亡。脂筏能为死亡受体聚集提供膜交换平台。最近的研究表明脂筏在启动死亡信号转导时发挥了重要作用。这些结果提示脂筏功能的失调也许是胃癌对TRAIL不敏感的原因之一。某些化疗药物,比如表阿霉素、紫杉醇、顺铂,能够增强肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。奥沙利铂是第三代含铂药物,奥沙利铂为基础的化疗方案对胃癌的疗效优于顺铂为基础的方案。有研究报道顺铂通过促进脂筏聚集增强了结肠癌细胞对Fas配体的敏感性。是否奥沙利铂能通过调节脂筏从而增强胃癌细胞对TRAIL的敏感性还不清楚。脂筏的功能受多种因素的调节。泛素连接酶Cbl家族是重要的调节因素。Cbl蛋白包括3个同源体,c-Cbl,Cbl-b和Cbl-3。c-Cbl和Cbl-b有相似的结构和功能。有研究报告c-Cbl和Cbl-b能够从T细胞和肥大细胞的脂筏中清除信号分子,导致脂筏无效聚集。此外,T细胞Cbl-b的缺失能促进抗原诱导的受体聚集和脂筏聚集。但是c-Cbl和Cbl-b是否能调节胃癌细胞的脂筏,并因此影响胃癌细胞对TRAIL的敏感性尚不明确。为增强胃癌细胞对TRAIL的敏感性,我们将奥沙利铂和TRAIL联合应用。本实验以人胃癌细胞株MGC803,BGC823,SGC7901为模型,对脂筏在奥沙利铂和TRAIL联合诱导细胞凋亡过程中的作用进行了研究,同时对脂筏聚集的调节因子c-Cbl和Cbl-b在此过程中的调控机制进行了初步探讨。材料与方法1、采用MTT法测定细胞活力。2、采用流式细胞仪通过PI-Annexin V染色进行细胞凋亡判定。3、采用流式细胞仪通过DiOC6染色进行线粒体跨膜电位测定。4、采用Western blot检测c-Cbl,Cbl-b,caspase-3,caspase-8,Bax,Bcl-2蛋白的表达。5、采用免疫荧光显微技术观察细胞膜脂筏和死亡受体的分布。6、采用Lipofectamine 2000试剂进行瞬时转染。7、统计学处理:每次实验重复3次,数据以（?）±s表示,两组间差异采用Student’s t test分析。P＜0.05有统计学意义。实验结果1、在MGC803,BGC823和SGC7901细胞中,100ng/mL的TRAIL导致轻度的增殖抑制,诱导不超过6%的细胞凋亡。奥沙利铂在MGC803,BGC823和SGC7901细胞中24h抑制细胞增殖50%的药物浓度(IC50)分别是22.56±6.55,37.47±7.67和33.92±8.01μg/mL。与单药奥沙利铂和TRAIL相比,奥沙利铂(各自的IC50剂量)联合TRAIL（100ng/mL）引起明显的细胞增殖抑制和细胞凋亡。当奥沙利铂和TRAIL联合作用MGC803细胞后,可以见到更明显的线粒体跨膜电位下降,caspase-3和caspase-8裂解,Bcl-2表达下调。5-FU和TRAIL协同诱导胃癌细胞凋亡已有报道,在本实验中作为阳性对照。5-FU作用MGC803细胞48h抑制细胞增殖50%的药物浓度(IC50)是2.07±1.14μg/mL。与单药5-FU和TRAIL相比,5-FU(48h的IC50剂量)联合TRAIL（100ng/mL）引起明显的细胞增殖抑制和细胞凋亡。当5-FU和TRAIL联合作用MGC803细胞后,可以见到更明显的线粒体跨膜电位下降,caspase-3和caspase-8裂解,Bcl-2表达下调。2、与对照组相比,100 ng/mL TRAIL作用MGC803细胞没有引起明显的脂筏聚集和DR4,DR5聚集。但是22.56μg/mL奥沙利铂明显促进DR4和DR5在聚集脂筏内的定位。奥沙利铂和TRAIL联合作用与奥沙利铂单药相比,引起脂筏和死亡受体共聚集的程度相似。3、制霉菌素是一种胆固醇分离剂能破坏脂筏。用50μg/mL制霉菌素预处理MGC803细胞1h,部分阻止了奥沙利铂引起的脂筏聚集和DR4,DR5聚集。制霉菌素处理MGC803细胞24h后引起了少量的细胞凋亡。加入奥沙利铂前用制霉菌素预处理1h,有减少奥沙利铂诱导细胞凋亡的趋势。此外,加入奥沙利铂和TRAIL前用制霉菌素预处理1h,凋亡细胞的比率由41.79±5.48%减少到29.52±3.99%。4、22.56μg/mL奥沙利铂作用MGC803细胞8h后轻度抑制了c-Cbl和Cbl-b的表达,处理16h和24h后明显减少了c-Cbl和Cbl-b的表达。100ng/mL TRAIL作用MGC803细胞16h没有改变c-Cbl的表达,但轻度上调了Cbl-b的表达。奥沙利铂和TRAIL联合作用MGC803细胞16h后,下调c-Cbl和Cbl-b的程度与单药奥沙利铂下调的程度相似。5、使用Lipo2000瞬时转染野生型c-Cbl和Cbl-b的表达载体进入MGC803细胞,转染48h后用Western blot的方法证实c-Cbl和Cbl-b的表达量提高。与阴性对照相比,在c-Cbl,Cbl-b,c-Cbl联合Cbl-b转染的细胞中,奥沙利铂,奥沙利铂+TRAIL诱导的MGC803细胞脂筏聚集被部分抑制。结论1、奥沙利铂增强TRAIL诱导的MGC803,BGC823和SGC7901细胞凋亡。在协同作用中有更明显的线粒体跨膜电位下降,caspase-3和caspase-8裂解,Bcl-2表达下调。5-FU和TRAIL作用胃癌细胞后也有相似的结果。2、奥沙利铂促进MGC803细胞的DR4和DR5募集在聚集的脂筏内。3、制霉菌素部分阻止了奥沙利铂诱导的脂筏聚集和DR4,DR5聚集,并减少了奥沙利铂和TRAIL诱导的MGC803细胞凋亡。4、在MGC803细胞内,奥沙利铂下调了c-Cbl和Cbl-b的表达。5、在MGC803细胞内,c-Cbl和/或Cbl-b的过表达部分逆转了奥沙利铂诱导的脂筏聚集。