从古至今,各种传染性疾病的爆发和流行严重危害着人类的生命和健康。补体结合试验作为一种经典的血清学技术已广泛用于多种传染病病原体的检测。与酶联免疫吸附试验(ELISA)相比,免去了蛋白的固定、封闭、洗涤及酶标抗体的使用,大大简化了实验步骤。然而传统的补体结合试验在试管或孔板里进行,存在试剂用量大,反应时间慢和受实验室操作地点限制等缺陷。另外,其结果的测定通常是用肉眼观察反应后溶液的澄清度和红细胞沉积量,所以灵敏度不高。随着科技的进步,现代检验医学出现了现场即时检验的发展趋势。微流控芯片是一种“微”而“全”的分析技术平台,具有低成本、易操作、分析速度快、耗样量小、体积小便于携带和自动实现检测等诸多优点,已成为实现即时检验的重要技术手段。为了推进检验医学的即时检测,本文致力于构建几种简单易操作的微流控芯片,以此为操作平台改进传统的补体结合试验或结合鲁米诺化学发光实现对病原标志物快速、灵敏、低成本的检测。主要研究结果如下:1、构建Polydimethylsiloxane(PDMS)/玻璃微流控芯片及结合补体结合反应用于病原标志物CEA和rH7N9的检测本研究构建双通道和三通道的PDMS/玻璃复合微流控芯片作为微型生物反应平台进行补体结合反应。首先根据液相和固相补体结合试验的实验特点,设计并加工制作两通道和三通道结构的PDMS/玻璃微流控芯片分别用于实施液相和固相补体结合试验。其次,在96孔板里用传统的方法对补体和溶血素浓度进行优化。优化实验选用的病原标志物为癌胚抗原(CEA)。实验选用1%的低熔点琼脂糖包裹红细胞作为固相指示系统,并对其和红细胞混合体积比进行了优化。然后将具有特定结构的PDMS/玻璃芯片固定于PMMA夹具中形成微器件装置,由于PDMS的柔软可形变性使得微器件装置在夹具的压力作用下具有调控芯片中不同腔体间液体隔绝和交流的功能。用液相的红绿色食品染料对微装置特征进行了验证,并以此建立补体结合试验的样品系统和指示系统。优化实验结果表明最适宜观察溶血现象的条件为:溶血素与红细胞的浓度比为1:125,补体浓度为每毫升40单位,1%低熔点琼脂糖与红细胞的最优体积比为1:5。在以上优化条件下,芯片上的液相和固相补体结合试验成功实现了一系列未知浓度目标物(癌胚抗原CEA和重组甲型禽流感r H7N9)的快速检测,并通过在人血清中特异性检测rH7N9和CEA成功证明了芯片补体结合试验在实际活检中的可行性。本芯片补体结合试验体系不仅继承了补体结合试验中操作简便的优点,还具有来自微流体平台的快速测定和低样品消耗的优势。它可作为微流控免疫分析法如ELISA的补充或备份工具用于疾病的即时诊断。2、构建纸基流控芯片及结合补体结合反应协同鲁米诺化学发光用于快速、灵敏的病原标志物rH7N9的检测由于铁蛋白能催化鲁米诺-过氧化氢反应产生很强的化学发光(CL)信号,而血红蛋白中的血红素含有二价铁离子,因此将鲁米诺化学发光反应运用于补体结合试验中可感知放大生理性补体介导的胞溶血信号,实现病原蛋白的超灵敏检测。在对H2O2浓度的优化条件下,该实验体系对未知浓度rH7N9的线性检测范围为0.25 fg/mL-25 ng/mL,最低检测线为0.14 fg/mL。在构建PDMS-玻璃微流控芯片进行补体结合试验和鲁米诺化学发光协同补体结合反应实现超灵敏蛋白质检测的研究基础上,我们继续开发了低成本的纸基微流控芯片作为操作平台实施补体结合试验,并加入鲁米诺化学发光反应放大溶血信号。与PDMS/玻璃芯片相比,纸芯片的制备更简单、成本更低,能真正实现便携式、一次性分析。纸基阵列芯片采用一次性光刻微通道于封口膜上并将其熔渗入纸里的方法制作。纸基-Parafilm?复合3D微流控芯片采用切割封口膜成型微通道结构,随后将其与聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料膜层压的方法制作。整个制作过程只需10分钟。纸基阵列芯片用于开展液相补体结合试验。首先对纸上低熔点琼脂糖的有无、样品系统和指示系统在纸芯片上的反应时间、待检纸芯片与鲁米诺/H2O2纸芯片的相对位置等条件进行优化。实验结果表明:加有琼脂的实验组能得到更好的实验结果;30分钟是纸芯片上样品系统和指示系统进行溶血反应的最佳时间;鲁米诺/H2O2纸芯片覆盖在样品芯片的上面能得到更好的CL信号。在以上优化条件下,纸芯片上的液相补体结合试验结合鲁米诺化学发光实现了对未知浓度rH7N9的快速检测。纸基-Parafilm?复合3D微流控芯片开展固相补体结合试验,在鲁米诺化学发光的协同作用下成功实现了对未知浓度rH7N9的快速检测,并对两组抗原抗体(牛血清白蛋BSA和重组甲型禽流感rH7N9)的特异性反应进行了探索。本实验体系结合了纸基微流控芯片、鲁米诺化学发光和补体结合试验三种技术的优势,比PDMS/玻璃微流控芯片的补体结合免疫分析更具有低成本、快速的即时检测潜力。