论文部分内容阅读
研究目的：光动力学疗法(Photodynamic Therapy, PDT)的核心是光敏剂。叶绿酸e4是由本研究组研制开发的具有自主知识产权的最新的新型光敏剂,其光动力学特性以及对膀胱癌的光动力杀伤效果和机制尚未明确。为此,本研究旨在探讨叶绿酸e4的制备及其光动力学特征,明确其体外、体内对膀胱癌光动力杀伤作用和作用机制,为其临床应用治疗膀胱癌提供基础资料。研究方法：1、以中药蚕砂为原料,提取得到叶绿素粗制品,经过碱水解、分离、提取、纯化等步骤得到叶绿酸e6,再由叶绿酸e6转化为叶绿酸e4。2、采用质谱仪分析叶绿酸e4分子量,高压液相色谱分析样品的纯度,使用荧光分光光度计分析其吸收光谱和吸收峰等光学特性。3、体外培养膀胱癌T24和5637细胞到对数生长期,应用MTT法检测不同浓度的叶绿酸e4结合不同能量650nm波长激光对膀胱癌细胞的生长抑制作用,探讨叶绿酸e4光动力学治疗对T24和5637细胞的体外杀伤作用。4、采用流式细胞仪观察叶绿酸e4光动力学处理T24和5637细胞后死亡情况；透射电镜技术观察T24和5637细胞超微结构的变化,判断细胞器形态变化和有无发生凋亡。5、将叶绿酸e4与T24和5637细胞孵育后,再用线粒体特异性探针标记线粒体,以激光共聚焦显微镜为成象工具,研究叶绿酸e4在细胞内的亚细胞分布。6、采用细胞凋亡蛋白抗体芯片技术,检测T24和5637细胞光动力处理前后,包括Bcl-2、Bax、Bad、Caspase-3、Caspase-9和细胞色素C、SMAC等凋亡相关蛋白的表达情况,探讨叶绿酸e4光动力学作用诱导T24和5637细胞凋亡的可能机理。7、建立大鼠原位膀胱癌模型,初步观察叶绿酸e4介导的光动力学作用对大鼠膀胱癌的体内杀伤效果。研究结果：1、制备得到的叶绿酸e4,样品纯度为94.28%,相对分子量为553,在可见光的红光区域均有很强的吸收峰,吸收峰为661.5nm、606.0nm、501.5nm、403.5nm。2、叶绿酸e4各浓度2.5、5和10μ g/m1对T24细胞生长抑制率在4J/cm2下为20.03%、49.77%和82.43%,在1J/cm2为6.1%、77.38%和79.32%,各浓度500ng/ml、1μ g/m1和2μ g/ml对5637细胞生长抑制率在4J/cm2下为16.61%、29.11%和85.06%,在1J/cm2为13.39%、57.94%和71.20%。3、T24细胞在10μ g/ml叶绿酸e4和4J/cm2激光条件下,光动力处理后,行流式细胞检测,细胞凋亡率为32.04±1.3%、坏死率为7.12±0.7%,细胞对照组凋亡率为3.77±0.3%、坏死率为2.61±0.4%；5637细胞在2μ g/m1叶绿酸e4和4J/cm2激光条件下,光动力处理后,行流式细胞检测,细胞凋亡率为45.33±1.7%、坏死率为3.64±0.7%,细胞对照组凋亡率为5.64±0.7%、坏死率为1.57±0.4%。4、T24和5637细胞光动力学处理后,透射电镜检测显示线粒体明显肿胀变性呈空泡样变,细胞核内染色质核染色质固缩,边集在核膜下,呈境界分明的颗粒状或新月形,凋亡小体形成。对照组无相应改变。5、T24和5637细胞与叶绿酸e4和线粒体探针孵育后,行激光共聚焦显微镜检测显示504nm激发叶绿酸e4发出的红光与488nm激发线粒体探针产生的绿光分布基本一致。6、在T24细胞处理组中促凋亡蛋白Bid、Bax、Bad均较对照组有明显的升高；而抗凋亡蛋白Bcl-2明显下降,Bcl-w蛋白相较于对照组也有下降;处理组细胞色素C为对照组的1.8倍；Caspase9和Caspase3处理组有不同程度的升高；促凋亡蛋白SMAC处理组高与对照组；凋亡抑制蛋白XIAP处理组明显低于对照组；在5637细胞PDT处理组中促凋亡蛋白Bid、Bax、Bad较对照组有明显的升高；而抗凋亡蛋白Bcl-2明显下降,Bcl-w蛋白对照组也有下降；处理组细胞色素C水平高于对照组;Caspase9和Caspase3处理组有不同程度的升高；促凋亡蛋白SMAC处理组高与对照组。7、叶绿酸e4在20J/cm2激光能量下对大鼠膀胱癌光动力处理后,观察到明显成片的肿瘤组织的坏死(4/4)。研究结论：1、制备的叶绿酸e4纯度高,光学特性符合理想光敏剂要求。2、叶绿酸e4结合650nm激光,体外光动力学杀伤膀胱癌T24和5637细胞显著,具有剂量和能量依赖性。3、叶绿酸e4主要定位在肿瘤细胞线粒体中,通过诱导线粒体途径的快速凋亡实现杀伤肿瘤细胞作用的。4、T24和5637细胞经PDT处理后,促凋亡蛋白Bid、Bad、Bax较抑制凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-w等占优势,线粒体中细胞色素C、SMAC及凋亡诱导因子等释放入细胞质,激活了Caspase-9,随后再激活其他Caspase,共同作用诱导细胞发生凋亡。5、叶绿酸e4介导的光动力学作用对大鼠膀胱癌,有明确的杀伤效果。