植物表皮毛起始于几乎所有陆地植物的地上部分表皮细胞,分为单细胞和多细胞两种类型。表皮毛作为研究植物细胞命运调控的模式系统,越来越受到人们的重视。拟南芥表皮毛为典型的单细胞结构,其调控机制已经进行了深入的研究,即通过MYB-bHLH-WD40蛋白复合体调节下游基因的表达,从而控制表皮毛的分化发育。棉花纤维作为一种与单细胞表皮毛类似的结构,其起始分化的调控机制与拟南芥表皮毛相似。但是,金鱼草、矮牵牛、烟草、番茄等体表的多细胞表皮毛起始分化的调控机制与拟南芥和棉花不同。番茄Woolly (Wo)基因能够促进多细胞表皮毛的形成,因此该基因的分离鉴定对于揭示多细胞表皮毛形成的调控机制至关重要；同时,由于Wo纯合会导致胚胎死亡,因此该基因的研究对于揭示番茄胚胎发育的调控机制也具有重要意义。本研究采用图位克隆的方法分离鉴定了Wo基因,并对该基因的表达模式、亚细胞定位、下游调控基因等进行了深入的分析,预测了番茄表皮毛形成和胚胎发育的调控模式。主要结果如下：1.比较番茄第二条染色体对应的ILs图谱与Tanksley 1992年发表的高密度分子遗传图谱,确定Wo位于该染色体长臂的中间区域,并推断该基因位于RFLP标记CT38下侧。以woolly突变体LA3186为母本,IL2-3和IL2-5为父本,构建了F2遗传分离群体。利用从IL2-5×LA3186获得的分离群体对Wo进行了粗定位,确定该基因位于分子标记W124和C2At5g64670之间；进一步利用从IL2-3×LA3186获得的分离群体对该基因进行了精细定位,确定该基因位于STS64和STS62之间,分别与STS64和STS62发生了1次交换,并与STS4共分离。2.对STS64和STS62所在BAC克隆C02HBa0006L05和C02HBa0204D01进行序列比对,发现这两个BAC的末端序列完全相同(15328 bp),形成了一个Contig (-200Kb),说明Wo位于该区域内。利用基因预测软件FGENESH和GENESCAN对该区域进行基因预测,确定该区域含有19个可能的ORFs.其中ORF-4编码730 aa,包含三个保守的结构域：HD、bZip和START,与拟南芥中调控表皮分化的基因PDF2具有73%的同源性。因此,我们将ORF-4作为候选基因。3.设计全长引物,以LA3186和Ailsa Craig的gDNA和cDNA为模板扩增获得全长基因；测序、比对发现从LA3186上扩增的全长基因发生了由胞嘧啶(C-1904)向鸟嘌呤(G)的转变,而且在该突变位点保持杂合状态；另外,该突变造成了由脯氨酸(Pro-635)向精氨酸(Arg)的转变。4.利用载体pMV2构建了该位点两个等位基因的超量表达载体；利用载体pHELLSGATE2构建了RNAi抑制表达载体。以LA3186分离的正常番茄植株为受体,采用农杆菌介导的遗传转化方法获得转基因植株。表型分析发现含突变位点的基因超量表达以后,植株表皮毛密度会有不同程度的增加。其中两棵表现尤其明显,但是这两棵植株矮小、叶片皱缩、无侧根形成、生长缓慢。未突变的基因超量表达以后,没有发现表皮毛的改变。RNAi抑制表达植株的表皮毛变化明显,呈现“无毛”表型。实验结果表明ORF-4即为Wo基因。转基因材料的共分离分析进一步证明我们的候选是正确的。5. Wo在幼茎、功能叶、茎尖、花、果、根等不同组织中的RT-PCR分析显示,该基因在各个组织中均有表达,在幼茎和茎尖中的表达量最高,在花和果实中的表达量次之,在根和功能叶中的表达量最低。原位杂交分析显示,Wo在幼茎的表皮、叶原基、顶端分生组织、侧芽原基等部位有较强的表达。LA3186和正常番茄之间没有明显的表达差异。Wo启动子驱动GUS-YFP表达,发现在茎尖、茎、叶腋、幼叶和成熟叶等部位均有表达,在幼嫩部位表达量最高,包括茎尖、叶腋和幼叶基部；另外在Ⅶ型表皮毛的腺体细胞、侧根原基以及发育中的胚胎特异表达。6.亚细胞定位结果显示Wo所编码蛋白定位于细胞核和细胞膜。7.胚胎的细胞学观察显示,花后第7天败育胚胎与正常胚胎呈现明显差异,随着正常胚胎的发育分化,逐渐经过球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚等阶段,而败育胚胎没有出现分化,只有细胞数量的增加。8.半薄切片的观察结果显示番茄表皮毛形成初期的形态各不相同,每种表皮毛的基部细胞均具有不同的特点。SEM观察表明LA3186的Ⅰ型表皮毛显著增加,并且出现了簇状毛；而RNAi抑制表达植株则表现为该型表皮毛的完全消失。9.等位突变体LA0053(Wo-)、LA1531(Wov)和MF802(未知)、LA0258(Wom)和LA1908(Womz)中Wo的全长序列分析显示：LA0053和MF802的突变位点与LA3186相同,保持杂合状态,均由胞嘧啶(C-1904)突变为鸟嘌呤(G),也造成了由脯氨酸(Pro-635)向精氨酸(Arg)的转变；LA0258和LA1531发生了单碱基突变,突变位点与前面3个突变体不同,由鸟嘌呤(G-1700)突变为胸腺嘧啶(T),保持纯合状态,造成了由精氨酸(Arg-567)向亮氨酸(Leu)的转变,其中LA1531的分析结果与番茄遗传资源中心的记录不一致,它把LA1531归为纯合致死一类；LA1908也发生了单碱基突变,由胸腺嘧啶(T-2075)突变为胞嘧啶(C),也导致了氨基酸的替换,异亮氨酸(Ile-692)转变为苏氨酸(Thr)。10.在NCBI中与Wo所编码氨基酸序列同源的11个不同物种的基因进行序列比对分析,发现Wo与它们的同源性位于46%-79%之间,而且3个等位突变位点在这11个同源基因中均高度保守,说明这3个位点可能具有重要的生物学功能。11.芯片杂交结果显示,以正常番茄材料作为对照,在LA3186中总共有186个差异表达基因,其中上调表达的基因有159个,占所有差异表达基因的85.5%；下调表达的基因有27个,占所有差异表达基因的15.5%。12.U226950在LA3186、LA0258、LA1908均上调表达。基因预测发现该基因全长321 bp,不含内含子,编码106个氨基酸,与拟南芥中一个功能未知的B型周期蛋白基因AT5G06270.1同源性达到55%,因此将其命名为SlCycB 2。另外一个B型周期蛋白CYCLIN B1;2在GL2启动子驱动下能够诱导簇状毛和多细胞表皮毛的形成,但是该基因与SlCycB 2没有显著的同源性。由于LA3186多细胞表皮毛(Ⅰ型)和簇状毛的显著增加,表明SlCycB 2可能也参与该型表皮毛形成的调控。13. SICycB 2的表达分析表明该基因的表达与Wo具有类似的分布特点,属于组成性表达,其中在幼茎、茎尖和花中的表达量比较高,在功能叶和根中的表达量较弱；SlCycB 2在Wo相关转基因植株中的表达分析表明,在超量表达植株中该基因的表达量相应提高；在抑制表达植株中,该基因表达量则受到抑制。说明SlCycB 2的表达可能受Wo的调控。14.利用载体pHELLSGATE2构建了SlCycB2的RNAi抑制表达载体,以LA3186为受体转化获得转基因植株,表达分析确认该基因在转基因植株中的表达受到明显抑制,表型观察发现表皮毛密度明显减少。SEM观察显示,该基因的转基因植株Ⅰ型表皮毛几乎完全消失,而且多分枝表皮毛显著增加。15. SICycB2启动子序列分析发现其中含有一个11 bp的顺式元件—CTAATTGTTTA,据报道该元件能够与HD结构域相结合。但是,酵母单杂交实验表明Wo并不能与该元件结合,说明Wo对SlCycB 2的表达调控可能不是通过与其启动子的直接结合来实现的。BiFC和酵母双杂交实验均显示Wo和SlCycB 2所编码的蛋白之间存在直接的互作关系,说明Wo对SlCycB 2的表达调控可能是通过蛋白互作来实现的。16.基于B型周期蛋白调控细胞周期G2期向M期的转换,我们推测：Wo通过蛋白互作的方式促进SlCycB 2的表达,从而促使细胞从G2期向M期的转换,最终促进Ⅰ型表皮毛的形成和胚胎的败育。这一调控模式不同于拟南芥表皮毛和棉花纤维的调控,是一种新的调控机制。