论文部分内容阅读
背景与目的:龋病是一种发病率很高的疾病,现代病因学认为龋病是一种细菌感染性疾病,其发生与多种因素有关,其中牙菌斑在牙面的形成是龋病发生的先决条件。大量的研究表明在牙菌斑的形成及致龋过程中变形链球菌起着至关重要的作用,被认为是主要的致龋菌。变形链球菌在牙面的粘附、聚集是其致龋作用首要的和关键的一步,也是最为重要的一步。因此通过主动或被动免疫的方法来封闭、失活变形链球菌菌体表面参与粘附和聚集的毒力因子,阻止变形链球菌在牙面的粘附聚集从而降低其致龋力,一直是龋病免疫预防研究的焦点。近年来,随着基因治疗的飞速发展,防龋DNA疫苗的研究也成为龋病防治领域的热点。在前期的研究中我们已经成功地构建了载有与变形链球菌最初附着有关的表面蛋白抗原AgⅠ/Ⅱ的唾液结合区段（Saliva-binding region,SBR）基因的双启动子表达载体pCN-SSIE（含真核启动子CMV和原核启动子Nir）,和载有变形链球菌葡糖基转移酶葡聚糖结合区（Glucan-binding region,GBR）基因的表达载体pTriEx-4-GBR,且证实了它们的免疫原性。本实验的目的是构建载有SBR和GBR基因的二价双启动子表达载体pCN-SSISG。并检测其在原核细胞减毒沙门氏菌SL3261中的表达情况以及以减毒沙门氏菌为DNA疫苗载体通过口服在动物小鼠体内免疫的情况。方法:根据GenBank公布的S.mutans glucosyltransferase（gtfB and gtfC）genes基因序列（序列号M17361）设计一对特异性引物,上游引物5′端含有限制性内切酶HindⅢ位点;下游引物5′端含有XhoⅠ的酶切位点。利用PCR技术从载有变形链球菌gtfB基因的质粒中扩增葡聚糖结合区段（GBR）的基因片段,然后将合成的组织纤溶酶原信号肽序列（tPA-SP）连接到GBR基因的上游,再将此基因（sGBR）定向克隆到载有sSBR基因的双启动子表达载体pCN-SSIE上,构建出pCN-SSISG.。通过酶切分析和DNA测序证明双启动子表达质粒pCN-SSISG构建成功后,再用该质粒转化减毒沙门氏菌SL3261,并用转化子口服免疫小鼠;同时利用在前期研究中已构建好的原核表达载体pTriEx-4-SBR和pTriEx-4-GBR在大肠杆菌JM109（DE3）中分别诱导表达抗原蛋白SBR和GBR,并应用HisTrapTM蛋白纯化试剂盒纯化后,皮下免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,酶联免疫吸附实验（ELISA）和Westemblotting检测pCN-SSISG在原核细胞减毒沙门氏菌SL3261中表达SBR和GBR蛋白的情况,和以减毒沙门氏菌为载体在小鼠体内诱导的全身及粘膜免疫反应情况。结果:通过对重组质粒pCN-SSISG的酶切鉴定以及DNA序列测定分析,证明重组表达载体pCN-SSISG构建成功、开放阅读框架正确;SDS-PAGE表明在减毒沙门氏菌SL3261中pCN-SSISG能正常表达目的蛋白,其条带大小与预期结果相符,Western blot也检测到了SBR和GBR蛋白的表达。这些结果表明质粒可以在原核细胞中正常工作。同时用ELISA间接法和Western blotting检测口服免疫小鼠的血清抗体,结果显示制备的小鼠血清能特异地结合在原核细胞中表达及纯化的SBR和GBR融合蛋白,酶联免疫吸附实验（ELISA）结果显示:在以减毒沙门氏菌为载体口服免疫的小鼠血清及唾液中,都检测到了明显高于对照组的高水平的抗SBR和GBR特异性抗体IgG、IgA。结论:本实验利用PCR、T-A克隆等分子生物学技术成功地将编码SBR及GBR的基因定向克隆到表达载体pCMVnir上,构建出了一个新的特别适合以减毒沙门氏菌为载体的二价双启动子DNA疫苗pCN-SSISG;它在原核细胞中能够良好地表达,且能诱导机体产生良好的免疫反应,为进一步的实验研究奠定了基础。