人参UDP-鼠李糖基转移酶的优化改造与应用

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人参皂苷是人参的主要活性成分,目前已经分离超过200多种。人参皂苷的主要苷元是原人参二醇和原人参三醇,而糖基化修饰是赋予人参皂苷结构多样性和功能多样性的关键步骤。糖基化修饰包括皂苷元的糖基化以及糖链的延伸。皂苷元的糖基化修饰通常是葡萄糖,而糖链的延伸除了葡萄糖外,还包括鼠李糖、木糖和阿拉伯糖等。这些不同糖基的延伸对人参皂苷的活性和生理功能有显著的影响。例如,人参皂苷Rg2在C-6具有鼠李糖延伸的糖链,其具有显著的治疗心血管疾病的功能。在课题组的前期研究中,对人参和三七的UGT94Q家族的糖基转移酶进行了系统的功能鉴定,获得了能在皂苷C-3,C-6和C-20位进行葡萄糖延伸的糖基转移酶,并且发现其中一些糖基转移酶同时具有催化鼠李糖延伸的活性,但是它们催化鼠李糖延伸的活性较低。我们对其中一个糖基转移酶UGT29-24进行改造和优化,尝试提高其催化人参皂苷Rh1利用UDP-鼠李糖生成人参皂苷Rg2的效率。首先,我们将UGT29-24与目前已经功能鉴定的UDP-鼠李糖基转移酶的PSPG盒子进行了比对,根据序列比对结果对UGT29-24进行突变获得突变体UGT29-24m2(S343G,A359P)(以后简称为UGT29-24m2)。结果表明,体外酶活反应体系中仅以UDP-鼠李糖为糖供体时,与催化利用UDP-鼠李糖生成人参皂苷Rg2效率为0.4%的出发元件UGT29-24相比,UGT29-24m2蛋白催化利用UDP-鼠李糖生成人参皂苷Rg2的效率提高到了11.6%。然后,我们对UGT29-24进行了同源建模并与糖基供体UDP-鼠李糖和糖基受体人参皂苷Rh1进行了分子对接分析,根据分子对接结果推测了对稳定UDP-鼠李糖上的甲基有重要作用的三个氨基酸位点,并对这三个氨基酸进行迭代突变,结果表明体外酶活反应体系中仅以UDP-鼠李糖为糖供体时,迭代突变体UGT29-24m4(S343G,A359P,F15W,F362Y)(以后简称为UGT29-24m4)催化利用UDP-鼠李糖生成人参皂苷Rg2的效率从11.6%提高到了53%。随后我们对四突变体UGT29-24m4重新进行了同源建模和分子对接分析,结果发现UGT29-24m4与UDP-鼠李糖的结合能显著降低,同时突变体UGT29-24m4与UDP-鼠李糖分子间形成的氢键数目增加,使得UGT29-24m4与糖基供体UDP-鼠李糖的结合更加容易,对UDP-鼠李糖的利用效率更高。最后,我们在UGT29-24m4基础上对可能影响底物结合口袋大小的I54位点进行了突变,结果表明与UGT29-24m4蛋白相比,反应体系中仅供应UDP-鼠李糖时,迭代突变体UGT29-24m5(S343G,A359P,F15W,F362Y,I54M)(以后简称为UGT29-24m5)催化人参皂苷Rh1利用UDP-鼠李糖的效率从53%提高到了93.5%。通过对UGT29-24的五轮优化改造后,我们将UDP-鼠李糖基转移酶催化人参皂苷Rh1利用UDP-鼠李糖生成人参皂苷Rg2的催化效率从0.4%提高到了93.5%,提高了近232倍。接着我们又测试了存在UDP-葡萄糖竞争的条件下,出发元件UGT29-24与迭代突变体UGT29-24m5蛋白元件催化人参皂苷Rh1利用UDP-鼠李糖的效率。结果表明,在UDP-鼠李糖与UDP-葡萄糖等摩尔浓度的条件下(0.5 m M),UGT29-24催化利用UDP-鼠李糖的效率为0,而UGT29-24m5催化利用UDP-鼠李糖的效率为13.8%。为了完成人参皂苷Rg2酵母细胞工厂的构建,我们尝试在产人参皂苷Rh1的酵母底盘细胞中构建UDP-鼠李糖合成途径。我们将一个能够利用NADH合成UDP-鼠李糖的鼠李糖合酶Vv RHM-NRS导入到人参皂苷Rh1酵母底盘细胞中,然后再进一步将鼠李糖基转移酶UGT29-24m5导入到酵母基因组单拷贝位点从而完成了人参皂苷Rg2酵母细胞工厂的构建,通过摇瓶发酵,人参皂苷Rg2的产量达到1 mg/L。
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