【摘 要】
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种高度传染性的猪病,给我国养猪业带来了很大的经济损失。我国流行的非洲猪瘟病毒已经从刚开始强毒株为主向多种基因Ⅱ型毒株共存转变,虽然致病力明显降低,但仍具有很强的水平传播能力。而且随着野毒株和疫苗株的重组,出现多种基因型并存的局面,给我国消灭非洲猪瘟病毒带
【基金项目】
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扬州大学高层次人才科研启动项目； 江苏省重点研发（现代农业）（编号:BE2020398）； 国家自然科学基金委面上项目（编号:32072833）；
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的一种高度传染性的猪病,给我国养猪业带来了很大的经济损失。我国流行的非洲猪瘟病毒已经从刚开始强毒株为主向多种基因Ⅱ型毒株共存转变,虽然致病力明显降低,但仍具有很强的水平传播能力。而且随着野毒株和疫苗株的重组,出现多种基因型并存的局面,给我国消灭非洲猪瘟病毒带来了更加严峻的挑战。截至目前,我国尚无非洲猪瘟疫苗上市,未经严格程序批准使用的疫苗的安全风险隐患极大。严格的生物安全措施和快速准确的诊断与清除技术是非洲猪瘟防控最有效的手段,已在我国的非洲猪瘟防控发挥了至关重要的作用。因此,研发用于非洲猪瘟病毒的快速血清学检测方法具有重要的现实意义。目前,对于非洲猪瘟病毒的血清学检测方法包括传统的ELISA检测、胶体金免疫层析试纸条、免疫印记等,但这些检测方法都存在检测重复性差、检测仪器与实验条件要求较高。本研究开发了一种基于荧光素酶免疫沉淀系统的非洲猪瘟血清学诊断方法,并对其做了优化以达到更好的检测效果。将非洲猪瘟病毒蛋白p30编码序列克隆到慢病毒载体pLVX-CMV中,与慢病毒包装质粒pCMV-VSV-G、psPAX2共转染HEK-293T细胞,收集细胞培养上清获得表达GLuc-p30抗原的慢病毒溶液。将慢病毒溶液转导HEK-293T细胞后,用嘌呤霉素筛选获得稳定表达GLuc-p30的稳定细胞株。基于嘌呤霉素和绿色荧光信号筛选,我们成功建立了稳定表达GLuc-p30的多克隆HEK-293T细胞株。将获得的细胞株进行连续传代,各个代次细胞培养上清中的GLuc酶活性稳定在2×107光子计数。运用已知ASFV阳性和阴性的猪血清,我们建立了基于荧光素酶沉淀系统（LIPS）的ASFV血清学检测方法。通过对LIPS反应条件进一步优化,包括包被条件优化、封闭条件优化、孵育条件优化、重组抗原加入量优化,以及尝试使用不同的荧光素酶融合抗原等,建立了一种基于荧光素酶免疫沉淀系统的非洲猪瘟血清学诊断方法。此外,本研究还建立了基于Nluc-p30的LIPS检测方法。与基于p30的间接ELISA检测方法相比,我们的LIPS方法具有更好的检测敏感性与便捷性。本研究建立并系统优化了一种基于非洲猪瘟病毒p30蛋白的荧光素酶免疫沉淀系统,通过构建稳定表达GLuc-p30融合蛋白的细胞株,无需纯化,简化了抗原的准备过程。本研究建立的LIPS检测方法可以用于ASFV血清学检测,具有广阔的市场前景和可创造良好的社会经济效益。
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