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人α-半乳糖苷酶(Humanα-Galactosidase A,α-Gal A)是由人X染色体上GALA基因编码的溶酶体糖蛋白水解酶,负责水解溶酶体里面的寡聚糖、糖脂、糖肽末端的α-半乳糖残基。α-Gal A缺乏导致神经酰胺三己糖苷(Ceramide trihexoside,GL3)在人体各组织中积累,最终诱发法布雷病。作为一种X染色体连锁遗传性溶酶体贮积病,法布雷病临床症状主要表现为青年脑卒中、左心室肥大等,严重威胁人类健康。目前,酶替代疗法(Enzyme replacement therapy,ERT)是治疗法布雷病最有效的方法,已批准上市的α-Gal A分别是由中国仓鼠卵巢细胞和人成纤维细胞表达的。然而,由于当前的α-Gal A表达体系表达量低、成本高,导致法布雷病患者的治疗费用高昂,无法满足法布雷患者的需求。因此,寻找安全可靠的表达体系以制备足够的α-Gal A用于法布雷病的治疗迫在眉睫。里氏木霉(Trichoderma reesei,T.reesei,RUT-C30)是无性型红褐肉座菌属嗜温丝状真菌,具有较好的蛋白合成和分泌能力,具有真核细胞的分泌机制,并且其N糖基化和高甘露糖型等与哺乳动物表达体系相似。此外,里氏木霉已经获得美国食品药品监督管理局(Food and drug administration,FDA)的“一般认为安全(Generally recognized as safe,GRAS)”认证,其在生产过程中无致病性、无真菌毒素和抗生素产生,为α-Gal A在里氏木霉中的高效表达及生产提供一种可能的体系。虽然里氏木霉具有良好的工业化蛋白生产潜力,但目前科研界对其研究仍不够深入,可供在此菌中研究的高效表达载体寥寥无几,并且外源药用蛋白的表达量仍然很低,使得里氏木霉表达体系的应用受到很大限制。因此,本研究通过构建里氏木霉通用表达载体,并将其应用于α-Gal A的表达研究。目的:构建里氏木霉通用表达载体,以期实现α-Gal A的高表达为法布雷病的治疗提供新选择。方法:(1)构建里氏木霉表达载体:(1)提取里氏木霉染色体DNA,通过设计引物以及PCR扩增和纯化载体元件,将纯化好的载体元件DNA片段用重组酶连接,利用测序和凝胶核酸电泳检测,判断里氏木霉表达载体pTRUC是否成功构建。(2)以m Cherry红色荧光蛋白为报告基因,构建pTRUC-m Cherry质粒,利用荧光显微镜、PCR及Western blotting方法分析和鉴定载体的功能。(2)研究里氏木霉表达α-Gal A融合蛋白:(1)将经过密码子优化的GALA基因与纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase I,CBH I)基因融合并与pTRUC表达载体连接,构建pTRUC-CBH I-HGal表达质粒,并转化至里氏木霉,利用Western blotting检测相应蛋白表达量。(2)利用q PCR检测α-Gal A重组菌中非蛋白折叠响应(Unfolded protein response,UPR)&内质网相关蛋白降解途径(ER-associated degradation,ERAD)途径相关基因的转录水平。结果:(1)里氏木霉表达载体的构建:(1)测序和凝胶核酸电泳检测结果显示里氏木霉表达载体pTRUC构建成功;(2)荧光显微镜下观察到m Cherry重组菌的荧光信号,在基因组PCR中检测到m Cherry;Western blotting检测到m Cherry的特异性条带;结果表明红色荧光蛋白m Cherry能在里氏木霉中表达。以上结果说明该载体构建成功,外源基因能在里氏木霉中正确表达。(2)里氏木霉表达α-Gal A融合蛋白的研究:(1)Western blotting结果表明CBH I和α-Gal A融合蛋白(CBH I-HGal)成功在里氏木霉中表达,且发酵2天后,CBH I-HGal在发酵上清中的积累量最多;最适硫酸铵沉淀浓度为70%;GALA基因能在里氏木霉基因组中稳定传代至第4代且CBH IHGal成功表达。(2)q PCR结果发现α-Gal A重组菌UPR响应中免疫球蛋白结合蛋白Bip基因的转录量与亲本菌株没有显著差异,二硫键异构酶Pdi的转录量显著高于亲本菌株,氧化还原酶Ero基因的转录量显著低于亲本菌株;而α-Gal A重组菌表达α-Gal A的表达量仍较低,说明α-Gal A重组菌表达α-Gal A时没有激发UPR响应。而ERAD途径中泛素连接酶Hrd1、Der1、Hrd3基因的转录量与亲本菌株有显著差异;葡糖基转移酶Gpt、葡糖基水解酶Gls2、α-甘露糖苷水解酶Mns1基因的转录量是亲本菌株的4-6倍,有极显著差异,说明α-Gal A重组菌表达CBH I-HGal融合蛋白激发了ERAD途径。UPR响应和ERAD途径相关基因的转录水平为后续研究α-Gal A在里氏木霉中的表达调控机制提供了理论基础。结论:成功构建里氏木霉通用表达载体实现α-Gal A在里氏木霉中的表达,为法布雷病的治疗提供可靠科研依据。