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本论文对一种新型的抗肿瘤疫苗HCG β核酸疫苗的分离纯化工艺进行了初步研究。探索了一条细胞破碎,样品浓缩,及利用色谱层析技术大规模分离纯化质粒DNA的分离纯化工艺。
首先用碱裂解法处理以大肠杆菌为表达宿主发酵得到的湿菌体,考察了碱裂解中各参数对质粒DNA产量的影响,确定菌体湿重/悬浮液/裂解液/中和液的最佳比例为lg:2ml:2ml:2ml,碱裂解最佳操作时间为8~10min,经过几次平行实验取平均值,碱裂解后的质粒得率可达54.9mg/L。经过离心过滤除去大部分杂质并浓缩样品,其后利用色谱层析技术进行进一步的分离纯化。
分别选用两种不同的色谱层析方法对粗样品经行分离纯化。其一是将碱裂解后的粗样品直接用Sepharose 6 FF凝胶过滤层析对去除RNA,再用Plasmidselect亲和层析捕获超螺旋质粒DNA。其二是对碱裂解后的粗样品用硫酸铵和乙醇沉淀浓缩后,用L-Histidine-agarose亲和层析一步分离纯化超螺旋质粒DNA。实验发现:两种方法均可得到单一形式的超螺旋质粒DNA。前一种分离方法的优点是处理量大,一次就可以处理80ml的碱裂解后粗样品,质粒DNA的得率为48.3%。后一种方法虽然可以达到一步分离纯化scpDNA的目的,缩短了操作时间且简化了工艺,但是处理量很小(2ml),质粒DNA得率为51.62%。考虑到临床上大规模生产超螺旋pDNA的需求,选用前一种方法更为合适。