食品在加工、生产、运输、储藏和销售过程中,极易受到腐败菌和致病菌的污染,而导致腐败变质。食品变质不仅会造成巨大的经济损失和环境污染等问题,同时还会严重危害人类的健康。随着生活水平的提高和科学技术的进步,食品安全问题日益受到消费者的关注,绿色和健康的食品为大众所推索,因而将安全、高效、天然的食品防腐保鲜剂应用到食品工业中势在必行。乳酸菌是公认的、安全的微生物和益生菌,将其广泛应用到许多食品的发酵中已具有几千年的历史。乳酸菌代谢产生有机酸、过氧化氢、CO2和细菌素等,通过不同的作用机制抑制其他微生物的生长,延长食品的保质期,保证食品的品质和安全。此外,乳酸菌及其产生的活性代谢产物与人类健康息息相关。因此,将乳酸菌及其代谢产物应用于食品防腐保鲜中已成为食品防腐保鲜研究与开发的热点。本论文从多种传统发酵食品中分离的148株乳酸菌出发,筛选得到一株具有广谱抑菌活性的希腊魏斯菌D1501；确定其在中性发酵上清液中产生的抑菌物质的化学本质为蛋白质类细菌素,然后采用多种传统分离方法和色谱分离技术联用对细菌素进行分离和纯化,并利用MALDI-TOF-MS、N端测序和肽指纹图谱(PMF)进行鉴定；此外对细菌素的理化稳定性和抑菌谱进行研究；希腊魏斯菌D1501除产生细菌素外,还能产生广谱抑菌活性的非蛋白质类物质一苯乳酸和羟基苯乳酸,并通过Plackett-Burman试验设计和最陡爬坡试验设计,使二者产量均得到显著提高；由于希腊魏斯菌D1501具有广谱抑菌性,所以将其作为保护性发酵剂和新型豆腐生物凝固剂,开发出一种新型长保质期的活性乳酸菌豆腐。为开发新型天然乳酸菌防腐保鲜剂及乳酸菌作为保护性发酵剂在食品保鲜中的应用提供了理论基础。主要结果如下：1.广谱抑菌活性乳酸菌的筛选及发酵特性的研究利用琼脂扩散法,对本实验室从传统发酵食品中分离的148株乳酸菌的抑菌特性进行研究。通过初筛和排除酸干扰的复筛,最终筛选出一株具有广谱抑菌活性的菌株D1501。菌株D1501是本实验室已鉴定乳酸菌,为希腊魏斯菌(Weissella hellenica)。通过单因素实验确定当在起始pH 6.0的MRS液体培养基中,接种量为3%(v/v),培养温度为37。C,培养24 h时,希腊魏斯菌D1501中性发酵上清液的抑菌活性达到最鬲。2.细菌素weissellicin D的分离、纯化和鉴定希腊魏斯菌D1501中性发酵上清液中的抑菌物质对蛋白酶敏感,确定其为蛋白质类的细菌素物质,并命名为weissellicin D.采用硫酸铵分级沉淀、Superdex 75pg分子筛凝胶过滤和Mono-Q离子交换对weissellicin D进行分离和纯化。利用Tricine-SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS确定细菌素的分子量为62425 Da,是目前已报道的魏斯菌属所产生的细菌素中分子量最大的。利用Edman降解法发现细菌素weissellicin D的N端封闭。利用肽质量指纹图谱法(PMF)对细菌素一级结构进行鉴定,细菌素weissellicin D被胰酶水解后的所有肽段信息在NCBInr数据库中没有得到完全匹配。而细菌素weissellicin D和Lactobacillus ultunensis DSM16047的ABC超家族ATP结合转运蛋白的匹配度最高,但蛋白质覆盖率只有19%。因此,希腊魏斯菌D1501产生的细菌素weissellicin D是一个具有特殊结构且未被报道的新型乳酸菌细菌素。3.细菌素weissellicin D的理化特性、抑菌谱和抑菌特性细菌素weissellicin D在pH 2.0-8.0范围内均具有抑菌活性。细菌素weissellicin D具有良好的热稳定性,在121。C高压灭菌15 min后仍具有抑菌活性。紫外照射对细菌素活性也无影响。不同化学物质(甲醇、乙醇、吐温-80、SDS、尿素和EDTA)对细菌素weissellicin D的抑菌活性没有影响,其中EDTA的添加能够显著提高抑菌活性。细菌素weissellicin D对多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母和霉菌均有抑菌活性,具有广谱抑菌谱。细菌素weissellicin D对大肠杆菌K-12的作用方式是抑菌方式,细菌素产生菌希腊魏斯菌D1501能够有效地和大肠杆菌K-12发生共絮凝。当希腊魏斯菌D1501和大肠杆菌K-12共培养时,希腊魏斯菌D1501能够有效地抑制大肠杆菌K-12的生长,同时促使细菌素提前产生。4.希腊魏斯菌D1501产非蛋白类抑菌物质的研究希腊魏斯菌D1501在MRS液体培养基中37。C培养24 h,苯乳酸的产量为128.31 mg/L(0.77 mM),羟基苯乳酸的产量为48.94 mg/L (0.27 mM),是目前报道的魏斯菌属中产量最高的。从希腊魏斯菌D1501发酵液提取的苯乳酸和羟基苯乳酸的粗提液,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和蜡样芽胞杆菌均具有显著的抑制作用。利用PB试验设计和最陡爬坡试验设计优化苯乳酸和羟基苯乳酸的产量：当培养基组成为葡萄糖46g/L、蛋白胨23 g/L、酵母膏5g/L、牛肉膏10g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2 g/L、K2HPO4·3H2O 2.62 g/L、MgSO4·7H2O 0.58 g/L、MnSO4·H2O 0.198 g/L、吐温-80 1.0 mL/L,苯丙酮酸6.5g/L、色氨酸1 g/L,起始pH 8.0,30℃培养108 h后,苯乳酸和羟基苯乳酸的产量均达到最高,分别为2.40g/L(14.46M)和242.95 mg/L(1.34mM),对比优化前分别提高了18.70倍和4.96倍。5.D1501作为保护性发酵剂在新型乳酸菌豆腐申的应用将希腊魏斯菌D1501和吉氏库特氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别在豆浆中共同培养,希腊魏斯菌D1501及其代谢产物能够有效地抑制三种腐败菌和致病菌的生长,并且36 h后检测不到这三株菌。通过单因素实验并结合感官评定,最终确定新型乳酸菌豆腐的制作工艺为豆水比1：8,希腊魏斯菌D1501的接种量为4%(v/v),MTG添加量为200 U/L,培养温度为37℃,在此条件下,乳酸菌豆腐色泽乳白,表面光滑,质地柔软且富有弹性。对比传统凝固剂制作的豆腐和乳酸菌豆腐在不同温度下储藏时细菌总数的变化情况,结果表明乳酸菌豆腐中的希腊魏斯菌D1501能够抑制杂菌的污染,从而延长乳酸菌豆腐的保质期。在37℃下储藏7 d、25℃下储藏14 d和4℃储藏21 d,乳酸菌豆腐的理化指标(pH、滴定酸度、持水力和质构)和乳酸菌活菌数的变化相对稳定。同时在储藏过程中,有机酸、多种具有抑菌活性的挥发性物质和细菌素类似物等不断产生,有效阻止腐败菌的生长,进一步确保了乳酸菌豆腐的长保质期和安全性。所以将D1501作为保护性发酵剂应用在豆制品体系中,一方面可以抑制或杀死腐败菌和致病菌,延长货架期,保证产品的安全性和稳定性；另一方面可使产品获得新的感官特性,丰富产品的多样性。