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本文采用基因组改组技术选育耐酸耐温L-乳酸产生菌株。以课题组前期诱变选育得到的米根霉耐酸突变株mut-8,mut-19及耐温突变株mut-5为基因组改组的出发菌库,经两轮原生质体递进融合、筛选获得能够在38℃、减少中和剂添加量的发酵条件下生长良好且产酸量和强度都得到提高改组菌株,并对其中一株改组菌株F1-26的发酵性能进行初步研究。
通过对菌体原生质体制备影响因素试验,确定原生质体制备条件:选择菌龄18 h的米根霉种子培养菌液,采用蜗牛酶,纤维素酶及溶壁酶按1:1:1配比,1.5 mg／mL组合酶浓度,32℃、pH为6条件下酶解2 h；缓冲液为0.6 mol／LNaCl高渗液；原生质体再生培养方式采用含有0.6 mol／LNaCl平板再生；可以得到原生质体制得数最高为2.74×106个／mL,再生率最高为6.8％。
分别制备mut-8、mut-19、mut-5原生质体,利用双亲灭活标记法进行标记,优化的灭活条件为:紫外照射180 s,50℃水浴热灭活6 min。原生质体融合后采用溴甲酚绿平板法初筛及发酵复筛,获得在添加40 g／L碳酸钙中和剂条件下产酸水平较高的耐酸融合菌株F1-26。对F1-26与两亲本株mut-8、mut-19进行对比试验得到:在发酵72 h时,L-乳酸产量分别达到最大值91.45 g／L、76.78 g／L、75.82 g／L,F1-26比两亲本株分别提高19.10％,20.62％；发酵42 h时,发酵强度达到最大,分别为1.67 g／L·h,1.61 g／L·h,1.59 g／L·h；F1-26发酵终点时葡萄糖转化率达到76.21％,高于出发菌株mut-8的65.66％和mut-19的66.51％。对调节副产物乙醇的乙醇脱氢酶(ADH)而言,F1-26比两亲本株mut-8,mut-19ADH酶活分别降低32.33％,23.06％。调节目标产物的乳酸脱氢酶(LDH)酶活分别上升16.35％,57.52％。第二轮基因组改组耐温耐酸菌株F2-7发酵温度从原来的32℃提高到38℃,中和剂添加量从60 g／L减少到40 g／L,发酵产L-乳酸产量为86.80 g／L。连续传代培养与发酵结果表明该菌株具备较好的遗传稳定性,初步实现了选育目的。
对改组前后的菌株通过双向电泳及PDQuest软件进行蛋白质表达初步分析,表明改组后菌株在总蛋白表达及表达量与原始菌株相比差异上比较明显。