甲型肝炎是由甲型肝炎病毒(HepatitisAVirus,HAV)引起的以肝脏炎症病变为主要表现的急性传染病,主要经由粪口途径传播,甲肝的暴发流行是全球主要的公共卫生问题之一。目前甲肝病毒只有一种血清型和六种基因型。通过对散发或暴发病例中的HAV流行株进行序列测定和分析,结合现场流行病学调查,可为甲肝的溯源研究提供有效的理论和技术支持。本研究分为两部分内容:第一部分:二代测序和全基因组序列分析甲肝病毒流行株基因特征目前VP1-2A连接区是HAV分子流行病学研究中最常使用的基因分型片段,但不同地区不同时间流行的HAV流行株在此片段可能存在完全一致的序列。本研究收集来源于我国四个不同地区的12份HAV血清标本,分为4个组(Gl、G2、G3、G4),每组VP1-2A连接区分型完全一致。尝试用二代测序的方法,对VP1-2A连接区序列进行测定,获得流行株的准种序列。12份血清标本分别获得21262-27285条(平均24352条)有效HAV序列,分别代表477-576条(平均507条)独特准种序列。各标本中频数最高的优势准种序列占其所有准种序列的41.26%-49.74%,其余的准种序列占比大多不超过1%。因G2组和G3组中均有不同时间地点采集的HAV血清标本作为对照,经比较每组中标本HAV准种序列间平均遗传距离的差异无统计学意义(P>0.05);同时选取标本中前20位、前100位以及全部准种构建系统进化树,结果表明尽管有对照存在,未能明确发现遗传距离与标本来源之间的关联,流行株之间的亲缘关系均非常接近。对G4组三株HAV流行株(KH6、KH7、KH8)进行全基因组扩增及序列测定,然后进行基因分型、同源性比较、系统进化分析和重组分析等。结果显示三株流行株均属于IA亚型,在全基因组区核苷酸差异率最高仅为0.1%。有文献报道,来自同一起暴发的流行株序列其全基因组核苷酸差异率可达到0.31%,据此推测三株流行株可能来源于同一起暴发事件。基于全基因组和分片段系统进化分析显示三株流行株均属于IA亚型,不同片段的分型位置有所不同,未发现重组事件。随着HAV全基因组序列数据库的不断完善,可为病毒重组现象的研究提供更多数据。对三株流行株的全长VP1-2A区进行克隆测序,各获得26条有效克隆序列。三株流行株标本内和标本间平均遗传距离分别为0.34%和0.35%,差异无统计学意义(P>0.05),表明流行株间亲缘关系比较近。流行株在VP1-2A连接区的核苷酸和氨基酸变异频率均高于部分VP1区。以上研究结果表明,获得HAV全基因组序列,可全面反映HAV流行株序列特征信息;结合现场流行病学调查工作及实验室检测分析,可进行详细的甲肝溯源研究。第二部分:和田地区甲肝病毒流行株基因特征分析甲肝病毒的抗原结构较稳定,仅有一个血清型,其抗原中和位点主要位于结构蛋白VP3和VP1区。新疆和田地区位于我国西部,其甲肝年发病率一直处于全国较高水平。因此了解HAV流行株结构蛋白区基因特征,尤其是监测抗原中和位点变异情况,对于甲肝流行的防控及甲肝疫苗的广泛使用具有一定的指导意义。本研究收集2016-2017年间和田地区散发或暴发的43份甲肝急性期病人血清标本,以及两份市售甲肝减毒活疫苗标本,经核酸提取、逆转录、巢式PCR扩增等步骤,获得结构蛋白VP3-VP1-2A区核苷酸序列,并进行亲缘关系、核苷酸和氨基酸序列同源性、抗原中和位点及选择压力分析。研究结果表明,43株流行株均为IA亚型,其结构蛋白VP3-VP1-2A区的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.8%-100%和99.3%-100%,2株疫苗株为IB亚型;43株流行株与两株疫苗株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为89.3%-90.2%和99.1%-99.7%。所有流行株和疫苗株序列在已发表的抗原中和位点处均未发生氨基酸替代,其中一株在VP3区第72位发生缬氨酸(Val)被异亮氨酸(Ile)替代,靠近抗原中和位点VP3-71位,值得进一步研究。所有流行株在结构蛋白VP3-VP1编码区均处于明显负向选择。通过对和田地区HAV流行株结构蛋白VP3-VP1-2A区基因特征进行分析,表明均为IA亚型,核苷酸序列存在一定差异,有多株流行株存在,但氨基酸序列较为保守,在已发表的抗原中和位点处没有变化。综上所述,HAV基因组的VP1-2A连接区片段仍是用于流行株分型和亲缘关系分析的常用手段;VP1-2A连接区分型完全一致的流行株,标本间准种序列平均遗传距离的差异无统计学意义,流行株之间的亲缘关系均非常接近;获得HAV全基因组序列,结合现场流行病学调查工作是能够进行更精确的溯源。本研究中新疆和田地区流行株均为IA亚型,有多株流行株存在,抗原中和位点未发生氨基酸替代,为进一步研究该地区HAV分子流行病学特征及甲肝防控奠定了基础。