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实验目的：氯吡格雷（Clopidogrel）属于吩噻吡啶类抗血小板药物，在临床上被广泛应用于心脑血管疾病的治疗，但临床上发现患者对氯吡格雷的药物代谢存在显著的个体差异，研究表明CYP2C19*2和*3位点的碱基多态性与药物代谢相关，因此对这两个位点的准确分型对指导氯吡格雷个体化用药有重要意义。本研究旨在建立一种灵敏度高、特异性强、操作方便并且可用于大量筛查的SNP分型方法，为指导氯吡格雷个体化用药打下基础。研究方法：1选择基于“分子开关”的SNP基因分型方法。设计3′末端硫代修饰的特异性引物结合高保真Pfu酶，用已知基因型的DNA为模板摸索最佳扩增条件，并探讨3′末端单硫代修饰和双硫代修饰引物对扩增特异性的影响，最终建立稳定的对CYP2C19*2和*3位点分型的方法。在此基础上，对104例外周血标本进行CYP2C19*2和*3位点进行基因分型，并与测序结果相比较，以进一步验证该方法可靠性。2鉴于单硫代修饰引物特异性不足的缺陷，探讨以Tth-SSB作为添加剂对反应特异性的影响。构建Tth-SSB质粒，在表达纯化出Tth-SSB后，首先确定其添加用于SNP分型的扩增体系中的最佳用量，在此基础上，考量其提高反应特异性的效果。最后将其用于CYP3C19*2和*3位点进行SNP分型，并与双硫代修饰引物结果相比较。同时还探讨了其他一些添加剂如二甲基亚砜、甜菜碱和海藻糖等对改进反应特异性的效果。研究结果：1建立了一种基于双硫代修饰结合高保真酶的SNP分型方法，利用该方法对104例外周血标本CYP2C19*2（681G>A）和CYP2C19*3（636G>A）的分型结果与平行测序结果一致，表明该方法简便、可靠，可用于临床指导氯吡格雷的个体化用药。2初步获得苏州地区CYP2C19*2位点三种基因型A/A、G/A、G/G频率分别为8.65%、36.54%和54.81%；CYP2C19*3位点三种基因型A/A、G/A、G/G频率分别为0.96%、9.62%和89.42%。3将1μg/25μL Tth-SSB添加到单硫代修饰引物的扩增体系后，可杜绝非特异性扩增，提高基因分型的准确性。Tth-SSB可以提高基因分型反应的特异性，并且对104例标本检测结果与双硫代修饰引物检测结果完全相同。4二甲基亚砜、甜菜碱、海藻糖添加到SNP基因分型扩增体系中，对提高特异性的效果不明显。结论：基于“分子开关”的SNP基因分型方法，高保真酶结合双硫代修饰引物，或者添加1μg/25μLTth-SSB的单硫代修饰引物的反应体系均可对CYP2C19*2（681G>A）和CYP2C19*3（636G>A）进行准确分型。该方法成本低廉、简单可靠，并可用于大量标本筛查，可推广至临床指导氯吡格雷个体化用药。