【摘 要】
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SKP1（S-期激酶关联蛋白1）是SCF型泛素连接酶的核心组分,与F-box家族成员直接结合而参入蛋白质降解途径,从而调节生命体的生长发育、激素信号传递和应对生物/非生物胁迫等生命活动。与原生生物、某些真菌和脊椎动物不同,植物中拥有多个SKP1同源物,了解植物体内SKP1的种类、数量、类型和功能对于解析SCF复合体的作用机制至关重要。目前,对该家族的认识主要来源于拟南芥和水稻等模式植物,小麦中SK
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SKP1（S-期激酶关联蛋白1）是SCF型泛素连接酶的核心组分,与F-box家族成员直接结合而参入蛋白质降解途径,从而调节生命体的生长发育、激素信号传递和应对生物/非生物胁迫等生命活动。与原生生物、某些真菌和脊椎动物不同,植物中拥有多个SKP1同源物,了解植物体内SKP1的种类、数量、类型和功能对于解析SCF复合体的作用机制至关重要。目前,对该家族的认识主要来源于拟南芥和水稻等模式植物,小麦中SKP1家族的研究报道甚少。鉴于此,本研究在蛋白质组水平对小麦SKP1家族展开了系统的生物信息学分析。同时,以小麦TcLr15为试验材料,获取了不同类型的SKP1成员,借助qRT-PCR技术明确其在响应激素信号和逆境胁迫下的表达模式,运用酵母双杂交技术验证其与F-box蛋白的互作情况。研究主要结果如下:1.自小麦蛋白质组中鉴定出115条SKP1序列,由101个基因编码。SKP1蛋白具有保守的SKP1和/或SKP1POZ结构域,根据结构域组成不同,可将其分为四组:SKP1、SKP1POZ、1 个 SKP1+1 个 SKP1POZ 和 1 个 SKP1+2 个 SKP1POZ,其中数量占主导的类型为1个SKP1+1个SKP1POZ。小麦SKP1蛋白均呈酸性,绝大部分预测在细胞核中发挥作用。该家族基因分布于小麦各个染色体上,3号和5号染色体上包含的SKP1基因最多。热图分析结果表明,少数SKP1基因在小麦5个组织的不同发育时期表达量均较高,另一部分在某一组织或特定的发育时期呈现高表达水平,而大部分在5个处于不同阶段的组织中不表达或呈低水平表达;部分小麦SKP1家族基因在干和/或热胁迫下的表达模式变化较大;一些响应真菌和细菌的入侵过程。蛋白互作网络图预测结果表明,SKP1蛋白能直接与Cullin和F-box蛋白相结合。2.以TcLr15为试验材料,获得了三个不同类型的SKP1基因TSK41（含有SKP1POZ结构域）、TSK43.2（含有SKP1结构域）和TSK62（含有SKP1和1个SKP1POZ结构域）。三个蛋白均为非球形,由无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠构成,皆为核定位蛋白。三个TSK基因均与小麦近缘种属植物,包括大麦、二穗短柄草、乌拉尔图小麦、粟、玉米和高粱等呈现非常近的亲缘关系,表明其进化上相当保守。3.表达模式分析表明,三种逆境相关激素ABA、SA和MeJA对三个TSK基因的表达影响不大;受干旱和盐处理后,三个TSK基因的表达量均先升高后降低,受氧化胁迫后其表达量均降低;三个TSK基因在叶锈菌侵染进程中虽呈现差异表达,但不同毒力菌株对其表达趋势影响不大。总体来说,NaCl和H2O2这两种胁迫能引起三个TSK基因更加剧烈的表达量变化。4.构建了包含三个TSK基因的酵母双杂交猎物载体:pGADT7-TSK41、pGADT7-TSK43.2和pGADT7-TSK62。与八个含有F-box基因的酵母诱饵载体（BD-TaPP2-A13、BD-TaSKIP27、BD-TaFBK19、BD-TaFBK50、BD-TaFBK34、BD-TaFBK71、BD-TaFBL14和BD-TaSKP2A）进行一对一互作验证。TSK41能够与TaFBK19和TaFBK34相结合;TSK62能够与 TaFBK19、TaFBK34、TaFBK71、TaSKP2A、TaSKIP27 发生相互作用。其他 17个组合在本试验中均为阴性结果。Y2H结果表明,小麦SKP1蛋白和F-box蛋白存在多种作用模式。
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