传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属成员,主要侵害雏鸡体液免疫中枢器官法氏囊中的B淋巴细胞前体。IBDV基因组由分节段的A、B片段组成,分别编码RNA依赖的RNA聚合酶VP1、衣壳蛋白VP2与VP3、病毒自身的蛋白酶VP4以及非结构蛋白VP5五种蛋白。目前VP4蛋白除作为一种病毒蛋白酶被认识外,其他一无所知,本研究分析了IBDV感染细胞内VP4蛋白的磷酸化修饰及功能。以杆状病毒表达的IBDV-VP4蛋白为免疫原,免疫6-8周龄雌性BALB/C小鼠,以HAT筛选培养基进行选择培养,以相应的偶联多肽和IBDV感染细胞进行ELISA和IFA筛选,结果获得6株稳定分泌的单克隆抗体细胞株4A8、5B2、5C7、5C9、7A4和7H8。亚型鉴定结果显示它们都是IgGl亚类,轻链为K型。结合表位预测与合成肽技术,鉴定出4A8、5B2、5C7三株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体共同识别磷酸化抗原表位VP4-Ser26,而杂交瘤细胞5C9分泌的单克隆抗体识别非磷酸化抗原表位12FQVPQNPVVDGILASPGVLRGAHNLDCVLREGATL46;杂交瘤细胞7A4和7H8分泌的单克隆抗体共同识别非磷酸化抗原表位18PVVDGIL24,18P和21DGIL24是维持该表位的关键氨基酸。为了深入分析IBDV感染细胞内磷酸化修饰的VP4蛋白,借助识别磷酸化Ser26和非磷酸化位点的VP4蛋白单克隆抗体,分析了IBDV感染和VP4基因转染细胞内的VP4蛋白,结果显示,细胞内存在Ser26磷酸化和非磷酸化两种不同形式的VP4蛋白,VP4蛋白主要存在于细胞骨架组分中,而胞质、膜以及核组分中VP4蛋白含量相对较少。在此基础上,我们通过构建VP4蛋白中已鉴定的四个磷酸化位点S26、S65、Y99和T162的丙氨酸、天冬氨酸单点和多点突变载体以及多聚蛋白VP243突变体,观察了VP4蛋白在细胞中的表达分布和这些位点的突变对于VP4蛋白剪切功能的影响,VP4蛋白分布实验结果显示,S26和Y99位点的突变对VP4蛋白的分布没有影响,S65D(不是S65A)位点的突变会导致VP4蛋白的弥散分布,T162A(不是T162D)的突变会明显延迟VP4蛋白聚集的发生；VP4蛋白酶的活性分析结果显示,S26、S65、Y99和T162的磷酸化与去磷酸化修饰对VP4蛋白酶的活性没有影响,但Y99或T162位点的突变会严重影响VP4蛋白剪切功能的发挥。IBDV感染过程中病毒蛋白相互关系的解析对于病毒粒子的组装和成熟的研究至关重要。为此,以DF-1细胞模型,借助免疫荧光双标记技术分析了VP4蛋白与IBDV其它编码蛋白之间的相互关系。激光共聚焦观察结果显示,在IBDV感染的DF-1细胞内以针状或棒状存在的是VP4蛋白,呈团块状的VP4蛋白与VP1蛋白、VP2、VP3蛋白存在共定位关系；而在转染的细胞中,VP4与VP1蛋白、VP2、VP3蛋白不存在共定位关系。免疫共沉淀实验进一步显示,在IBDV感染情况下VP4与VP1、VP3蛋白存在相互作用。然而,在基因转染的细胞中这种互作关系不存在。以上结果说明,在IBDV感染细胞中出现的VP4与VP1、VP2、VP3蛋白共定位和相互作用现象是IBDV多聚蛋白VP243造成的。