论文部分内容阅读
多氯联苯(PCBs)是一组持久性有机污染物和人类致癌物。PCBs虽被禁用多年,因其难降解性和新产生的污染,在环境中仍普遍存在并在局部地区呈现高度污染与人体暴露。PCBs依其两个苯环的空间关系分为共平面(类二噁英)PCBs和非共平面(非二噁英)PCBs。前者毒性主要经激活芳香烃受体(aromatic hydrocarbon receptor,AHR)而介导,后者则主要通过代谢活化产物产生毒性。共平面PCBs不仅是CYP1酶强诱导剂,并且大鼠CYP1A与斑马鱼CYP1A1可转化3,3’,4,4’-四氯联苯(PCB77)、3,3’,4,4’,5-五氯联苯(PCB126)成4-羟基代谢产物。然而,其它CYP1酶对共平面PCBs代谢和活化能力尚不清楚。目的1.观察不同共平面多氯联苯(PCB 77、PCB 81、PCB 126)在人CYP1酶(CYP1A1、CYP1A2及CYP1B1)作用下对哺乳动物细胞的遗传毒效应。2.采用着丝粒蛋白B(CENP-B)免疫荧光显色法,观察所形成微核是否含有着丝粒,以判断受试物诱发微核的形成机制(鉴别断裂作用与致非整倍体作用)。方法1.细胞毒性(CCK-8)实验采用CCK-8实验分析受试物对中国仓鼠肺(V79)细胞、重组表达人CYP1A1、1A2、1B1的V79细胞、人肝癌(C3A)细胞系的毒性。2.微核实验采用常规体外微核实验分析受试物对上述细胞系诱发微核效应,染毒/恢复时程分别为6 h/18 h与18 h/6 h两种。3.Hprt致突变实验采用Hprt致突变实验检测受试物诱发重组V79细胞基因突变效应。4.有丝分裂指数和细胞周期分析受试物处理细胞后对细胞行固定与染色,采用光学显微镜分析用有丝分裂指数的变化,并将细胞用PI染色后用流式细胞术分析受试物对细胞周期的影响。5.免疫荧光法显示微核着丝粒采用抗着丝粒蛋白B(centromere protein B,CENP-B)抗体以免疫荧光法检测微核是否含有着丝粒。6.统计学分析CCK-8实验结果采用方差分析,微核实验和致突变实验结果经合并二个重复测定之后作卡方分析,而微核着丝粒检测结果(n = 3)则采用t检验进行统计学处理。结果1.在5μmol/L～40μmol/L(接近溶解度)浓度三个共平面多氯联苯(PCB 77、PCB 81、PCB 126)对V79-Mz细胞均不诱发微核。然而PCB 81在6h/18 h(暴露/恢复时程)处理条件下对 V79-hCYP1B1、V79-hCYP1A1、V79-hCYP1A2 细胞均引起微核细胞率增高;在另一处理条件(18 h/6 h)下则三个受试受均诱发V79-hCYP1A2细胞微核形成,而对其它细胞系无作用。2.三个受试物在标准的Hprt致突变实验条件下对所有细胞系(V79-Mz、V79-hCYP1A1、V79-hCYP1A2、V79-hCYP1B1)在受试浓度范围(5μmol/L～40μmol/L)均未显示致突变作用(反应为阴性)。同时,作为实验的阳性对照苯并(a)芘(0.11μmol/L)(依赖CYP1A1和CYP1B1酶的间接致突变物)对V79-hCYP1A1和V79-hCYP1B1细胞系均诱导Hprt突变子显著升高;同样,黄曲霉毒素B1(依赖CYP1A2的间接致突变物)明显升高V79-hCYP1A2细胞的突变频率,说明受试的重组细胞表达的代谢酶具有相应的代谢功能,亦即这些细胞系对受试共平面PCBs的阴性结果有效。3.以PCB 81为代表性共平面多氯联苯化合物,采用抗CENP-B抗体免疫荧光法显示,PCB 81在6 h/18 h和18 h/6 h暴露条件下对V79-CYP1B1细胞诱发的微核均以CENP-B阴性者为主,分别占74%和65%。同时,已知断裂剂乙基甲基磺酸酯和致非整倍体剂长春新碱在该实验中诱发的微核着丝粒阳性率分别为22%和61%,与既往报道相符,说明将抗CENP-B抗体用于以免疫荧光法分析微核着丝粒的实验(作为经典的CREST实验的替代方法)是有效的。结论三个受试物在不同暴露时程下可被人CYP1B1、CYP1A2、CYP1A1活化为具有诱发细胞微核作用的代谢物;其中以CYP1B1对PCB81的作用最明显,其诱发微核机制为断裂作用。三个受试物对上述表达人CYP1酶的重组V79细胞均无诱发Hprt基因突变的作用。综上,受试的三个共平面PCBs在细胞内CYP1酶的代谢活化作用下可呈现强度与实验终点有限的遗传毒作用。