肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范围内发病率最高的恶性肿瘤之一,高居世界第五位,而在癌症相关死亡原因中高居第三位。尽管HCC可以通过手术切除治疗,但其适应症范围有限,治疗后也存在不良预后反应。通过药物治疗虽然能有效杀伤癌细胞,但也伴随着明显毒副作用和耐药性问题。因此,深入挖掘肝癌的发病机理,寻找HCC早期诊断靶点和预后评估标志物,仍是肝癌攻关过程中亟待解决的医学难题。DEK在mRNA和蛋白水平上发挥调控作用,在多种癌症的发生发展过程都出现明显上调表达。DEK最初来源于急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)的一种亚型,并以DEK-CAN融合基因的形式分离得到,其在多种癌症中都有关于功能机理等方面的研究,而在肝细胞癌中的作用报道甚少。在本研究中,为了解DEK在肝癌中的调控作用以及机制,我们以离体和在体两种情况对DEK在肝癌中的表达及其调控机制进行了初步研究,为寻找HCC早期诊断靶点和预后标志物奠定实验基础。实验中,我们首先检测了DEK在HCC细胞系、组织的表达水平;检测了DEK的剪切体1和剪切体2在HCC细胞系、癌组织的表达。其次,构建及鉴定DEK shRNA慢病毒的载体,通过包装,收集DEK shRNA慢病毒。应用慢病毒感染、质粒共转染肝癌细胞系,开展体外细胞实验,检测DEK在HCC的增殖、周期和迁移中的作用;继而在裸鼠体内证实DEK在HCC的增殖和转移中的作用。最后利用生物信息学分析技术筛选与DEK表达相关联的基因,分析其在由DEK基因介导的HCC细胞增殖EMT和迁移中的作用,进而解析了影响HCC增殖和迁移的可能通路。1.肝癌细胞DEK表达研究我们利用GEO microarray芯片分析了HCC患者癌组织及癌旁组织中DEK的表达差异;利用RT-qPCR的方法检测了DEK在正常肝细胞系和肝癌细胞系HepG2、SMMC7721、MHCC97L、MHCC97H、Hep3B的表达;检测了HCC患者癌组织及对应癌旁组织中DEK的表达;利用Kaplan-Meier分析DEK水平与肝癌患者生存率的关系。Microarray数据分析显示HCC患者癌组织相对于癌旁组织,表达明显上升。肝癌细胞系HepG2、SMMC7721、MHCC97L、MHCC97H、Hep3B相对于正常肝细胞L02,DEK表达明显上升。DEK在19组HCC患者的癌组织都表达上调。Kaplan-Meier结果显示DEK高表达与患者的不良生存显著相关。2.dek促进肝癌细胞增殖及侵袭我们利用分子克隆的方法将shdek构建于psi-lvrh1gh慢病毒载体。应用慢病毒包装系统进行包装并收集病毒液,利用绿色荧光蛋白标志确定慢病毒滴度。然后,利用慢病毒感染细胞,并加入puromycin筛选获得稳定低表达的肝癌细胞系。同样,利用分子克隆方法将dek剪切体1和剪切体2构建于pcdna3.1(+)载体并鉴定。利用质粒共转染方法和g418筛选的方式获得稳定高表达的肝癌细胞株。以转基因细胞为材料,应用mts检测dek对hcc细胞增殖的影响;应用平板克隆形成方法检测dek对hcc细胞克隆形成能力的影响;应用划痕的方法检测dek对hcc细胞迁移的影响;利用裸鼠成瘤动物模型及病理切片分析dek在体内对hcc的影响。实验结果显示,shdek及其对照载体等慢病毒的滴度测定达5×106tu/ml以上。成功获得稳定过表达dek剪切体1和剪切体2及相应的对照细胞系,可用于后续功能实验。用mts法证实dek可显著促进hcc细胞的增殖,其中,dek剪切体1的作用相关明显强于剪切体2;克隆形成实验证实dek促进hcc细胞克隆形成,dek两剪切体之间存在差异;划痕实验证实dek能促进hcc细胞划痕的愈合,两个剪切体之间的愈合速度无统计学差异;利用裸鼠荷瘤模型和病理切片分析,dek表达沉默后在体内显著抑制肿瘤的生长,阻碍肿瘤的转移。据此我们得出如下结论:dek缺失抑制肝癌细胞增殖和迁移生物学特性。dek剪切体1和剪切体2都促进肝癌细胞增殖和迁移生物学特性,剪切体2中49~82号aa的缺失仅对细胞增殖有一定的影响。3.dek肝癌细胞中的相关基因及作用机制研究应用pi染色法检测dek对hcc细胞周期的影响;利用cbioportal从tcga数据库中提取所需rna-seq数据,确定与dek具有相关性的基因;应用rt-qpcr方法检测dek对hcc细胞周期相关基因变化的影响;应用rt-qpcr和westernblotting的方法检测dek水平对hcc细胞表皮标志物e-cadherin变化的影响;应用westernblotting的方法检测dek水平对β-catenin变化的影响。。流式细胞检测结果显示dek对细胞周期有明显促进作用;rna-seq数据结果显示cdk1、cdk2、cdk4、pcna表达与dek呈正相关,e-cadherin表达与dek呈负相关;rt-qpcr结果证实dek表达及基因的相关性;westernblotting结果显示dek促进β-catenin的激活,而抑制细胞上皮标志物e-cadherin的表达增强。据此我们得出如下结论:dek通过调节细胞周期相关基因的表达而促进细胞增殖。通过激活β-catenin、抑制e-cadherin的表达而促进hcc细胞emt和迁移。总之,dek高表达在肝癌发生发展中发挥作用。dek表达沉默抑制细胞增殖和迁移,在体内延长成瘤时间,抑制癌转移。我们证实在hcc细胞中主要表达剪切体1,DEK蛋白中缺失的49~82位氨基酸是增殖必需的,对细胞迁移没有影响。我们还证实DEK通过调节细胞周期相关基因促进HCC细胞增殖,DEK可能是通过调控β-catenin/E-cadherin信号促进细胞迁移及EMT的变化。