斑马鱼中LMNA基因的克隆

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目的:LMNA基因及其编码蛋白lamin A/C异常能引起一组人类遗传病,称为核纤层蛋白病,哺乳动物中 LMNA基因有4个转录本,分别是 laminA、laminC、laminA10,laminC2,其中 laminA、laminC是主要的亚型,目前已证明脊椎动物中该基因与哺乳动物同源性较高,而在斑马鱼已成功克隆出laminA基因,laminC基因尚未克隆出,本实验利用3’RACE技术克隆斑马鱼laminC基因,以确定斑马鱼中LMNA基因不同的转录本,为进一步研究LMNA基因转录本的功能,奠定重要的基础。  方法:通过收集斑马鱼全时相的胚胎,利用trizol方法提取RNA,后根据3’race试剂盒所带的逆转录体系将所提取的total RNA逆转录成为cDNA。然后再使用TaKaRa LA Taq以反转录的cDNA为模板,进行套式PCR反应,套式PCR(巢式PCR)通过两轮PCR反应,使用两套引物扩增特异性的DNA片段,第二套引物功能特异性扩增位于首轮PCR产物的一段DNA片段,从而提高反应的特异性。最后将PCR产物直接送测序。  结果:成功运用巢式PCR方法克隆基因,得到了581bp的片段,并进行了测序,测序结果与laminA基因相似度达98%,未克隆到laminC基因。  结论:通过新实验技术验证了斑马鱼中可能只存在laminA基因,无laminC基因,但因目前laminA/C的剪接位点是针对哺乳动物的,斑马鱼是一种较低等的脊椎动物,所以可能斑马鱼中laminC的可变剪接位点不同于哺乳动物,其产生的转录本有所差异,所以需进一步进行功能试验以验证斑马鱼中有无laminC基因。
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