目的:阿片类药物成瘾的主要特征表现为强迫性和持续性药物使用。目前认为造成药物成瘾持续性和稳定性的物质基础在于在成瘾药物作用下产生了新的突触联系,也就是突触的可塑性变化。由于神经元的大部分突触输入在树突和树突棘上,许多对结构可塑性的研究集中在树突和树突棘的形态学改变。骨架肌动蛋白在维持神经元的形态及树突棘可塑性变化中发挥重要作用,但吗啡对神经元骨架肌动蛋白重构的影响及分子机制尚未阐明。本研究拟从影响神经元形态和功能的骨架肌动蛋白入手,在分子、细胞、整体水平上深入地研究长期吗啡处理对神经元骨架肌动蛋白重构的影响,探讨肌动蛋白结合蛋白在吗啡诱导的以肌动蛋白重构为基础的神经元突触可塑性中的作用,进一步深化阿片类药物成瘾的细胞及分子生物学机制。方法:1吗啡成瘾大鼠模型的制备:健康SD大鼠42只,雄性,体质量(200±20) g,由河北医科大学实验动物中心提供。按随机分组原则分为对照组、吗啡依赖1周组、吗啡依赖2周组和吗啡依赖4周组,每组7只,各依赖组均设对照。吗啡依赖组采用剂量递增法注射盐酸吗啡建立吗啡依赖模型,每日3次,连续7 d,日剂量按5, 10, 15, 20, 30, 40, 50mg.kg-1逐日递增,对照组给予等体积的生理盐水。第8天,每组随机选取2只大鼠,注射盐酸纳洛酮5 mg/kg,催促戒断症状,判断大鼠吗啡依赖模型是否建立成功。然后将吗啡依赖1周组与其对照组大鼠断头处死,分离相关脑区。吗啡依赖2周组、吗啡依赖4周组继续分别给予50 mg/kg盐酸吗啡,每天1次,连续注射1或3周。在最后一次给药后5小时断头处死大鼠,分离相关脑区。生理盐水对照组大鼠采用生理盐水取代盐酸吗啡,处理同吗啡依赖2周组和4周组大鼠。2 Western-blot检测大鼠脑组织中肌动蛋白及其结合蛋白的水平。脑组织在磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)中制备组织匀浆后,根据G-actin属于胞浆可溶性蛋白,F-actin为细胞骨架相关蛋白,采用不同缓冲液对这两种蛋白进行分步提取;脑组织匀浆后,提取总蛋白,检测大鼠成瘾有关脑区p-cofilin;Drebrin蛋白为F-actin特异性结合蛋白,因此drebrin蛋白裂解液包括两部分,与F-actin结合部分的蛋白和胞浆中游离部分蛋白,将脑组织匀浆后,提取两部分蛋白裂解液混合进行蛋白测定;对裂解液液用BCA试剂盒进行蛋白定量;用Western-blot检测吗啡依赖不同时段大鼠海马、额叶皮质、丘脑和纹状体中F-actin、G-actin、p-cofilin、drebrinA/E的表达变化。3海马神经元的原代培养:取出生24小时内的乳鼠,断头,取脑,放入冰浴的D-Hanks液中,分离海马,剪成约1mm3小块,加入4~5倍组织块体积的0.125%的胰蛋白酶,37℃,消化15分钟,种植液冲洗3次后,用火焰刨光的玻璃吸管吹打制成细胞悬液,用种植培养液将细胞浓度调至2-5×10-3/cm-2。将细胞悬液种于预先铺好多聚赖氨酸的24孔细胞培养板中,3～5小时后给细胞补液。24小时后,全量换成饲养液,以后每3天换1次液,分别于培养第7d、第18d进行药物处理。4 F-actin染色和免疫细胞化学:分别于各相应时间点提取细胞爬片标本,PBS轻洗3次,浸入4%多聚甲醛中固定30min, 0.1%TritonX-100透化处理5min,3%牛血清封闭30min,然后加入与F-actin特异性结合的异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽(5ug/ml)和兔抗鼠p-cofilin(1:100)4℃过夜。PBS洗3次,滴加Cy5标记的荧光二抗(1:1000),37℃湿盒中孵育1h。激光共聚焦显微镜进行扫描,分别用488 nm和633nm激发波长激发FITC和Cy5。LCS图像分析软件分析神经元胞膜及树突荧光强度。以每次试验中对照组平均荧光强度为参照计算吗啡处理组F-actin的相对荧光强度。结果:1吗啡依赖大鼠海马中F-actin、G-actin、p-cofilin和drebrinAE蛋白表达的变化(1)与对照组相比,吗啡依赖1周组和2周组大鼠海马中F-actin表达量没有显著性变化(见Fig.1.1A),吗啡依赖4周组海马中F-actin表达量上调90%(P<0.01)(见Fig.1.1A)。(2)与对照组相比,吗啡依赖1周、2周和4周组大鼠海马内G-actin表达量均没有显著性变化(见Fig.1.1B)。(3)与对照组相比,吗啡依赖1周组大鼠海马中p-cofilin蛋白表达量没有显著性变化(Fig1.1C),吗啡依赖2周组和4周组大鼠海马中p-cofilin蛋白表达量分别上调45%(P<0.05)和30%(P<0.05)(见Fig.1.1C)。(4)与对照组相比,吗啡依赖1周组大鼠海马中drebrin蛋白表达量没有显著性变化(见Fig.1.1D),吗啡依赖2周和4周大鼠海马中胞浆游离部分drebrin蛋白表达量分别下调30%(P<0.05)和28%(P<0.05)(见Fig.1.1D),但与F-actin结合部分drebrin蛋白表达量变化不明显。2吗啡依赖大鼠前额叶皮质中F-actin、G-actin、p-cofilin和drebrinAE蛋白表达的变化(1)与对照组相比,吗啡依赖1周组大鼠前额叶皮质内F-actin表达量没有显著性变化(见Fig.1.2A),吗啡依赖2周组和4周组大鼠前额叶皮质内F-actin表达量分别上调58%(P<0.05)和101%(P<0.01)(见Fig.1.2A)。(2)与对照组相比,吗啡依赖1周、2周和4周组大鼠前额叶皮质内G-actin表达量没有显著性变化(见Fig.1.2B)。(3)与对照组相比,吗啡依赖1周组大鼠前额叶皮质内p-cofilin表达量没有显著性变化(见Fig.1.2C),吗啡依赖2周组和4周组大鼠前额叶皮质内p-cofilin表达量分别上调93%(P<0.01)和88%(P<0.01)(见Fig.1.2C)。(4)与对照组相比,吗啡依赖1周、2周和4周组大鼠前额叶皮质内drebrinAE表达量没有显著性变化(见Fig.1.2D)。3吗啡依赖1周、2周和4周组大鼠丘脑中均未发现F-actin、G-actin、p-cofilin和drebrinAE蛋白表达量变化(见Fig.1.3A、B、C、D)。4吗啡依赖大鼠纹状体中F-actin、G-actin、p-cofilin和drebrinAE蛋白表达的变化(1)与对照组相比,吗啡依赖1周、2周和4周组大鼠纹状体内,F-actin、G-actin和drebrinAE这三种蛋白的表达没有显著性变化(见Fig.1.4A、B、D)。(2)与对照组相比,吗啡依赖1周组大鼠纹状体内p-cofilin蛋白表达量没有显著性变化(见Fig.1.4D),吗啡依赖2周组和4周组的大鼠纹状体内p-cofilin的蛋白表达量分别下调25%(P<0.05)和30%(P<0.05)(见Fig.1.4D)。5吗啡对海马神经元形态学的影响在发育期,吗啡处理2h后,突起开始回缩,吗啡处理24h后,突起塌陷,树突干呈现串珠样结构,吗啡处理72h后,树突分支增多,树突分支复杂性增加。在成熟期,吗啡处理24h后,棘突塌陷,吗啡处理72h后,树突分支增多,树突分支复杂性增加,并出现畸形棘突,如多头棘突等。6吗啡对海马神经元肌动蛋白重构的影响⑴吗啡对发育期海马神经元胞膜及树突干F-actin荧光强度的影响与对照组相比,吗啡处理30 min后海马神经元胞膜及树突干F-actin荧光强度无显著差异;吗啡处理2h后胞膜F-actin荧光强度没有显著性变化,而树突干F-actin荧光强度降低25%(P<0.01);吗啡处理24h后胞膜及树突干F-actin荧光强度分别降低了34.56%(P<0.01)和25.74%(P<0.01);吗啡处理48h后胞膜及树突干F-actin荧光强度无显著差异,但与吗啡处理24h组相比,胞膜F-actin荧光强度显著升高(P<0.01);与对照组相比,吗啡处理72h后胞膜F-actin荧光强度增加15.08%(P<0.05),而树突干F-actin荧光强度变化无显著差异,与吗啡处理24h组相比,胞膜F-actin荧光强显著升高(P<0.01)。(见Fig.2.2,2.4)⑵吗啡对成熟期海马神经元胞膜及树突干F-actin荧光强度的影响与对照组相比,吗啡处理30 min后胞膜及树突干F-actin荧光强度变化无显著性差异;吗啡处理1h后胞膜F-actin荧光强度变化无显著性差异,而树突干F-actin相对荧光强度增加了15.79%(P<0.01);吗啡处理24h后,胞膜及树突干F-actin荧光强度分别降低31.32%(P<0.01)和19.51%(P<0.05);吗啡处理72h后,胞膜F-actin荧光强度变化无显著性差异,而树突干F-actin荧光强度升高16%(P<0.01),与吗啡处理24小时组相比,树突干F-actin荧光强度变化具有显著性差异(P<0.01)。(见Fig.2.3,2.5)7吗啡对海马神经元肌动蛋白结合蛋白p-cofilin的影响结果显示,吗啡处理2h后,P-cofilin的水平降低了22.57%,但与对照组相比无统计学差异(P>0.05);吗啡处理24h后,p-cofilin水平降低了43.06%,与对照组相比有显著差异(P<0.01);吗啡处理48h后,P-cofilin的水平与对照组相比无统计学差异(P>0.05),与吗啡处理24h组相比显著升高(P<0.01)。(见Fig.2.6)结论:总之,长期吗啡处理可以诱导大鼠产生依赖,吗啡依赖时大鼠脑组织中肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白的水平发生显著变化,并呈现时间依赖性和脑区特异性。在培养的海马神经元中,吗啡处理改变了海马神经元树突棘形态,促进了海马神经元肌动蛋白的循环,吗啡诱导的海马神经元肌动蛋白重构可能与肌动蛋白结合蛋白p-cofilin的表达有关。