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背景与目的:我国是胃癌及其癌前病变高发的国家,形势严峻。胃肠道内窥镜检查是早期发现胃黏膜病变的最直接有效的手段。共聚焦激光显微内镜(Confocal Laser Endomicroscopy,CLE)形态成像功能和分子成像功能,使其在诊断胃癌及其癌前病变中具有独特的优势,然而目前研究数据有限。本研究旨在通过分析探头式共聚焦激光显微内镜(Probe-based CLE,pCLE)在诊断萎缩性胃炎(Atrophic Gastritis,AG)、胃黏膜肠上皮化生(Gastric Intestinal Metaplasia,GIM)及其亚型、低级别上皮内瘤变(Low-grade Intraepithelial Neoplasia,LGIN)和高级别上皮内瘤变(High-grade Intraepithelial Neoplasia,HGIN)中的效能,以及通过以荧光基团标记的抗HER2抗体作为分子探针,利用pCLE鉴别HER2过表达的胃癌细胞株和胃癌荷瘤鼠等一系列研究,来阐明pCLE在胃癌及癌前病变中的形态成像和分子成像作用。方法:1.共聚焦激光显微内镜在胃癌及癌前病变诊断中的作用本研究收集了 2013年12月至2014年11月于浙江大学医学院附属第一医院行上消化道pCLE检查的患者资料,由两名具有三年以上pCLE读片经验的内镜医师回顾性阅读每一位患者的pCLE保存录像,并以以下标准做出pCLE诊断。以"胃小凹数目减少、胃小凹开口扩张"作为AG的pCLE下诊断标准,以"观察到杯状细胞、柱状吸收细胞、纹状缘或绒毛状上皮"作为GIM的pCLE下诊断标准,以"轻、中度异型胃小凹结构(胃小凹宽度和上皮层厚度大小不一),微血管管径增大,不同程度的荧光素钠外渗,形态扭曲"作为LGIN的pCLE下诊断标准,以"胃小凹结构明显异型(上皮层明显形态改变)或无明显腺体结构,微血管形态不规则,管径增大,数目增多"作为HGIN的pCLE下诊断标准,以病理诊断作为金标准,统计分析pCLE诊断AG、GIM、LGIN、HGIN的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比、约登指数及相应95%置信区间(confident interval,CI)和符合率及κ值。此外,以"具有完整纹状缘的非分泌吸收细胞和散在分布的杯状细胞"作为完全型GIM的pCLE下诊断标准,以"胃黏膜上皮细胞和散在分布的杯状细胞,或由高柱状细胞和散在分布的杯状细胞排列而成的迂曲分支状胃小凹开口形态,且不可观察到纹状缘"作为不完全型GIM的pCLE下诊断标准,与HE染色诊断(新悉尼系统标准)进行比对,统计分析pCLE诊断不同亚型GIM与HE染色诊断的一致性。2.共聚焦激光显微内镜在胃癌分子成像中的研究主要包括细胞实验和动物实验。通过蛋白印迹实验检测两株人胃癌细胞系MGC-803和NCI-N87中HER2表达量情况;通过流式细胞术和细胞免疫荧光实验检测荧光基团标记的抗HER2抗体作为分子探针是否可特异性结合到HER2高表达的细胞系上;通过细胞增殖-毒性检测实验检测实验所用浓度的抗HER2抗体和对照抗体对细胞毒性有无差异;通过构建荷瘤鼠模型以及在荷瘤鼠模型上进行的活体荧光实验、pCLE成像实验,由两位富有经验的pCLE内镜医师对pCLE成像结果进行半定量化,即分级为-、+、2+、3+、4+,并进行皮下瘤和肝脏的HE染色及免疫组化实验,检测以荧光基团标记的抗HER2抗体作为分子探针,利用pCLE是否可以鉴别出HER2高表达的荷瘤鼠。结果:1.共聚焦激光显微内镜在胃癌及癌前病变诊断中的作用研究共纳入55例患者,以胃黏膜病变例数为基础,共计80个胃黏膜病变。以病理组织学诊断结果为金标准,pCLE诊断AG的灵敏度、特异度及相应95%CI分别为81.25%(95%CI,53.69%-95.03%)、98.44%(95%CI,90.46%-99.92%),符合率为 95.00%,κ 值为0.84;pCLE诊断GIM的灵敏度、特异度及相应95%CI分别为93.22%(95%CI,82.73%-97.81%)、90.48%(95%CI,68.17%-98.33%),符合率为 92.50%,κ值为0.81;pCLE和HE染色诊断完全型GIM的符合率为0.75,κ值为0.49,诊断不完全型GIM的符合率为0.79,κ值为0.48;pCLE诊断LGIN(金标准:病理诊断为轻度、中度或轻中度异型增生)的灵敏度、特异度及相应95%CI分别为82.35%(95%CI,55.80%-95.33%)、88.89%(95%CI,77.84%-95.04%),符合率为 87.50%,κ值为0.66;pCLE诊断HGIN(金标准:病理诊断为重度异型增生或胃癌)的灵敏度、特异度及相应 95%CI 分别为 95.65%(95%CI,76.03%-99.77%)、98.25%(95%CI,89.37%-99.91%),符合率为 97.50%,κ 值为 0.94。2.共聚焦激光显微内镜在胃癌分子成像中的研究蛋白印迹实验结果为MGC-803低表达HER2,而NCI-N87高表达HER2;流式细胞术和细胞免疫荧光实验结果为荧光基团标记的抗HER2抗体作为分子探针可以特异性结合到HER2高表达的细胞系上;细胞增殖-毒性检测实验结果提示实验用抗体浓度实验组和对照组对细胞毒性相近,不影响实验结果的解读;MGC-803荷瘤鼠和NCI-N87荷瘤鼠构建成功,活体荧光成像实验结果表明每只荷瘤鼠尾静脉注射4μg荧光基团标记的抗HER2抗体、避光饲养24小时可清楚观测到皮下瘤荧光量间的差异;pCLE成像实验半定量化结果为NCI-N87荷瘤鼠尾静脉注射荧光标记的抗HER2抗体中的8只为3+或4+,1只2+,尾静脉注射荧光标记的对照抗体均在2+及以下,免疫组化结果均为HER2过表达;MGC-803荷瘤鼠尾静脉注射荧光标记的抗HER2抗体中有3只为4+,免疫组化结果也均为HER2过表达,其余5只为2+及以下,免疫组化结果为其中1只为HER2过表达;MGC-803荷瘤鼠尾静脉注射荧光标记的对照抗体均在2+及以下,免疫组化结果均为HER2低表达。结论:pCLE可用于诊断AG、GIM、LGIN、HGIN,并可对GIM进行初步分型诊断。以荧光基团标记的抗HER2抗体作为分子探针,利用pCLE的分子成像功能,可以很好地鉴别出HER2过表达的胃癌细胞和荷瘤鼠。意义:本研究结果表明pCLE可用于诊断AG、GIM、LGIN、HGIN以及对GIM进行初步分型诊断,为pCLE的临床应用提供数据支持,并可以指导内镜医师利用pCLE诊断结果进行靶向活检,以提高检出率,降低漏诊率。本研究通过细胞系和动物模型实验首次阐明了pCLE在胃癌HER2分子成像中的作用,可以指导开展临床试验,这将在胃癌分子诊断及靶向治疗疗效预估和监测中发挥重要的作用。