论文部分内容阅读
肝细胞肝癌(hepataocellular carcinoma,HCC)在我国是很常见的一种恶性肿瘤,具有发病率较高,侵袭性极强,进展及其迅速,预后极差等临床特点,对患者生命造成严重的威胁。生长较为迅速,早期就容易出现淋巴管、血管及远处脏器转移等恶性临床病理特点,与肝癌患者预后较差有关。探索肝癌发生、发展的复杂的具体生物学机制,并系统阐明肝癌发生和进展的分子生物学变化,可为肝癌的诊治提供新的重要途径。MTDH(metaherin),也称人异粘蛋白,编码基因位于人体8号染色体长臂22区(8qq22),编码蛋白质的分子量约64 kda大小。2004年被报道在小鼠肿瘤模型中与乳腺癌细胞发生早期肺转移有关。目前研究发现人体一些癌组织中MTDH表达异常的增高,与肿瘤恶性的病理特征及不良预后均有一定的关系。癌蛋白表达上调机制比较复杂,很多因素均可涉及调控癌蛋白表达。本部分研究中我们分析比较了MTDH在肝、乳腺及甲状腺肿瘤及相应良性组织中表达情况。目前MTDH在肝癌、乳腺癌中表达与患者临床病理特征关系及预后已经见报道,而MTDH表达情况与甲状腺癌临床病理特征及预后未见相关研究。为探讨MTDH作为肿瘤分子靶向治疗的普遍性,同时本文作者有多年从事甲状腺外科工作经验,本部分我们分析了甲状腺癌组织中MTDH表达情况,并分析甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)患者MTDH表达与临床病理特征及预后关系,探讨MTDH作为恶性肿瘤分子靶向治疗靶点的普遍性。Micro RNA(miRNA)是一类非编码单链小分子的RNA,碱基大小约为19-25bp,科学家已经发现在哺乳动物细胞中存在成百上千的miRNA,这些miRNA参与了机体复杂的生物学活动过程,并且miRNA表达具有一定的组织特异性(tissue specific)及器官发展时序特异性(developmental stage specific manner)等特点。通过与m RNA的3′-UTR碱基部分或完全结合,miRNA在调节机体基因表达中发挥重要生物学作用。目前研究已经发现肿瘤组织与相应的正常组织miRNA表达谱有很大差异,部分miRNA表达上调,表达上调的miRNA可能发挥促进肿瘤进展的癌基因的作用,而表达下调的miRNA则可能具有抑制肿瘤进展的抑癌作用。MiRNA-30家族成员在肿瘤中一般表达下调,而miRNA-30家族成员在肝癌中的具体作用机制研究较少,其中,家族成员之一miR-30a-5p在其他肿瘤中常见报道,而肝癌中研究有限。本研究挑选miR-30a-5p为研究对象,检测其在肝癌组织中与癌旁组织中的表达差异,检测其对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721增殖、凋亡、迁移和侵袭转移能力的影响,及对HepG2肝癌细胞裸鼠皮下肿瘤组织成瘤影响。通过生物学信息预测发现MTDH是miR-30a-5p靶点,并分析miR-30a-5p与肝癌组织中MTDH表达相关性。肿瘤细胞不断增殖并明显的抗凋亡是其发生恶性进展的重要原因,而越来越多的研究发现PTEN/AKT参与调控肿瘤细胞抗凋亡,而且在调控肿瘤细胞失巢凋亡中同样发挥一定作用。PTEN/AKT信号通路也被报道与肿瘤细胞的迁移与侵袭有关,AKT可通过调控细胞迁移相关分子Rac1、cdc42和Rho等的表达,使肿瘤细胞骨架发生一定的重排,促进细胞发生迁移及转移。我们研究发现miR-30a-5p可能通过靶向调控MTDH蛋白表达,进而调控PTEN/AKT通路,参与发挥抑制肝癌细胞增殖并促进肿瘤细胞发生凋亡的作用。而miR-30a-5p对肝癌细胞HepG2和SMMC-7721迁移和侵袭的抑制作用,也可能通过靶向调控MTDH蛋白表达,进而调控PTEN/AKT信号通路来实现。第一章Metaherin蛋白在肝癌、乳腺癌及甲状腺癌组织中表达及意义目的MTDH在肝癌、乳腺癌中表达与患者临床病理特征关系及预后已见报道。MTDH表达情况与甲状腺癌临床病理特征及预后未见研究。为探讨MTDH作为肿瘤分子靶向治疗的普遍性,本部分我们分析甲状腺乳头状癌(PTC)患者MTDH表达与临床病理特征及预后关系,探讨MTDH作为恶性肿瘤分子靶向治疗靶点的普遍性。方法⑴采用免疫组化检测MTDH在肝癌、乳腺癌及甲状腺癌组织表达情况,并与良性组织中表达作比较;⑵分析PTC组织中MTDH表达与临床病理指标关系;⑶Kaplan–Meier比较PTC患者MTDH高表达与低表达组DSS,Cox比例风险模型分析PTC组织中MTDH表达的预后意义。结果⑴肝癌旁组织中MTDH表达阳性率为20%(2/10),肝癌组织中MTDH阳性表达率为66.67%(14/21)。⑵在乳腺增生组织中MTDH表达阳性率为20%(2/10),在乳腺癌中表达阳性率为72.7%(13/18)。⑶MTDH在结节性甲状腺肿及甲状腺腺瘤组织中表达阳性率均为10%(1/10),PTC中MTDH阳性表达率为37.2%(58/156),未分化癌为50%(3/6)。⑷MTDH表达与PTC患者肿瘤大小((p=0.030))、淋巴结转移(P=0.041)、远处转移密切相关(P=0.028),但和患者年龄、性别、包膜浸润情况、肿瘤是否多发及肿瘤分期无关,MTDH高表达与PTC患者较差的生存率有关。结论MTDH在肝癌、乳腺癌及甲状腺癌组织中表达增高,高表达MTDH与恶性肿瘤患者不良病理特征及较差的预后有关,可能为肿瘤分子靶向治疗提供重要的靶点。第二章MiR-30a-5p调控肝癌MTDH蛋白表达的分子机制研究目的探讨miR-30a-5p在肝癌组织中与癌旁组织中的表达差异,生物信息学预测miR-30a-5p的靶点,并分析miR-30a-5p与肝癌组织中MTDH表达相关性。方法⑴采用RT-q PCR检测miR-30a-5p在肝癌细胞中与相应的正常肝细胞,肝癌组织及相应的癌旁组织中的表达差异;⑵生物学信息技术预测miR-30a-5p的靶基因,Western blot和Luciferase assay进行初步验证;⑶免疫组化检测肝癌组织中MTDH表达,采用相关方法分析肝癌组织中MTDH免疫组化评分分数与RT-q PCR检测的miR-30a-5p相对表达的关系。结果⑴与相应的癌旁组织比较,miR-30a-5p在肝癌表达下调,肝癌细胞中miR-30a-5p表达也较正常肝细胞LO2表达降低;⑵生物信息学技术预测MTDH可能是miR-30a-5p的靶基因,Western blot证实miR-30a-5p可抑制MTDH蛋白表达,Luciferase assay验证MTDH可能是miR-30a-5p的靶基因;⑶相关分析肝癌组织中MTDH表达与miR-30a-5p呈负相关。结论MiR-30a-5p在肝癌组织中表达降低,miR-30a-5p可靶向抑制肝癌组织中MTDH癌蛋白表达。在肝癌组织中miR-30a-5p和MTDH存在负相关,表明miR-30a-5p可通过靶向调控MTDH的m RNA的3′-UTR,调控MTDH蛋白表达。第三章MiR-30a-5p调控MTDH/PTEN/AKT通路对肝癌细胞生物学影响的实验研究目的MiR-30家族成员在肝癌中的具体作用机制研究较少,本部分挑选miR-30a-5p为研究对象,检测其对肝癌细胞生物学影响,并探讨可能机制。方法⑴采用Lipofection2000转染技术过表达肝癌细胞HepG2和SMMC-7721内miR-30a-5p,CCK-8、克隆形成实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡;⑵划痕实验和Transwell侵袭小室实验分别观察miR-30a-5p过表达后对肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721的迁移和侵袭能力的影响。⑶采用si RNA技术,沉默肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中MTDH蛋白,观察对HepG2和SMMC-7721细胞增殖、克隆形成、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。⑷Western blot检测MTDH下游PTEN蛋白,探索miR-30a-5p对PTEN/AKT信号通路调控作用。结果⑴通过转染miR-30a-5p mimics入肝癌细胞株HepG2、SMCC-7721细胞,CCK-8实验发现miR-30a-5p过表达后可以抑制HepG2、SMCC-7721细胞的增殖能力(P<0.05),抑制克隆形成(P<0.05),流式细胞术显示miR-30a-5p过表达促进了HepG2、SMCC-7721细胞凋亡(P<0.05);⑵划痕实验表明miR-30a-5p过表达可抑制肝癌细胞迁移,Transwell侵袭实验表明miR-30a-5p过表达可明显抑制HepG2、SMCC-7721细胞的体外侵袭能力(P<0.05);⑶通过si RNA技术沉默肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中MTDH蛋白,结果明显抑制HepG2和SMMC-7721细胞增殖(P<0.05)、克隆形成(P<0.05),促进肿瘤细胞凋亡(P<0.05),细胞迁移和侵袭也受到抑制(P<0.05)。⑷Western blot结果表明miR-30a-5p可调控PTEN/AKT通路,过表达miR-30a-5p可抑制MTDH蛋白表达,从而促进PTEN蛋白表达,抑制AKT磷酸化激活。结论MiR-30a-5p可通过调控MTDH/PTEN/AKT通路,从而发挥抑制肝癌细胞HepG2和SMMC-7721增殖、克隆形成,并促进肿瘤细胞发生凋亡,抑制肝癌细胞迁移和侵袭。第四章MiR-30a-5p抑制肝癌细胞裸鼠成瘤的实验研究目的在本部分中我们继续挑选miR-30a-5p为研究对象,检测其对肝癌HepG2细胞裸鼠皮下成瘤的影响,观察miR-30a-5p对动物实验中肝癌细胞增殖是否同样具有抑制作用。方法⑴采用裸鼠皮下成瘤实验,观察过表达miR-30a-5p对肝癌细胞HepG2裸鼠皮下成瘤的影响;⑵免疫组化检测miR-30a-5p转染HepG2裸鼠肿瘤细胞MTDH表达;⑶免疫组化检测miR-30a-5p转染HepG2裸鼠肿瘤细胞核增殖抗原PCNA表达和核凋亡蛋白TUNEL蛋白表达;⑷Western blot检测miR-30a-5p转染HepG2裸鼠肿瘤细胞MTDH和PCNA蛋白表达,p-AKT蛋白表达。结果⑴通过裸鼠皮下成瘤实验,观察到肝癌细胞HepG2在转染miR-30a-5p后裸鼠皮下肿瘤的生长明显减缓,与对照组相比较miR-30a-5p转染组肿瘤的大小、质量均减少,差异有统计学意义(P<0.05);⑵MiR-30a-5p转染HepG2可明显抑制裸鼠皮下肿瘤组织MTDH表达;⑶MiR-30a-5p转染HepG2裸鼠皮下肿瘤组织核增殖抗原PCNA表达减低,而核凋亡蛋白TUNEL表达明显增加;⑷MiR-30a-5p可抑制裸鼠肿瘤组织AKT激活,抑制p-AKT形成。结论:miR-30a-5p可通过调控MTDH蛋白表达,抑制肝癌肿瘤细胞裸鼠肿瘤生长。