第一部分基于代谢组学胰腺癌血清与组织差异代谢物的筛查研究目的:胰腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)恶性程度高,早期诊断困难,临床上迫切需要可靠的早期诊断标志物对高危人群进行筛查和诊断。本研究使用非靶向代谢组学方法对胰腺癌血清和组织进行系统的代谢组学分析,筛选胰腺癌早期诊断血清标志物,有助于胰腺癌早期诊断和改善患者生存期。方法:1.本研究首先使用基于超高效液相色谱质谱平台对82例PDAC患者(其中早期PDAC 36例、晚期PDAC 46例)、36例胰腺囊性肿瘤患者(BP,其中IPMN 15例、MCN 9例、SCN 12例)、49例健康对照组(Ctr)的血清进行非靶向代谢组学分析,包括样本制备、色谱-质谱分析、代谢物鉴定和数据分析。数据分析包含单变量及多变量统计分析,单变量统计分析包括Student’s t-test和变异倍数分析,多维统计分析包括主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、偏最小二乘判别分析(Partial Least Squares Discrimination Analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal PLS-DA,OPLS-DA)。本研究使用OPLS-DA模型VIP>1.0和t检验P<0.05的标准,初步筛选祖间差异代谢物。随后使用VENN图选出PDAC vs Ctr、PDAC vs BP共有的差异代谢物,以及早期PDAC vs Ctr、早期PDAC vs BP共有差异代谢物,以上两组差异代谢物的交集作为早期PDAC候选差异代谢物,然后使用R软件对这些代谢物进行Lasso回归分析,使用逻辑回归分析观察临床混杂因素(包括性别、年龄、有无糖尿病史、高血压史、近期体重下降等)对差异代谢物的影响,使用相关分析评价CA19-9与代谢物的相关性,最终保留不受临床混杂因素影响且与CA19-9不相关的差异代谢物,建立最优模型,使用ROC曲线、敏感度、特异度来检验诊断标志物及其与CA19-9联合诊断PDAC的预测效能。使用MetaboAnalyst、KEGG通路数据库来实现层次聚类分析(Hierarchical clustering analysis,HCA)、网络及通路分析。2.本研究对51例PDAC组织(其中早期PDAC 32例、晚期PDAC 19例)、40个非肿瘤胰腺组织、14例胰腺囊性肿瘤组织(IPMN 3例、MCN4例、SCN 7例)进行非靶向代谢组学分析,单变量及多变量统计分析方法同胰腺癌血清代谢组学。聚类及通路分析同血清代谢组学。3.使用VENN图比较分析了 PD AC vs Ctr、PDAC vs BP血清及组织两种样本共同的差异代谢物及代谢通路,分析两种样本来源代谢组学结果的相似性。另外,还观察了筛出的血清代谢物在组织中的表达情况。结果:1.PDAC血清代谢组学中建立了多变量分析模型,PLS-DA、OPLS-DA模型结果显示PDAC和Ctr组、PDAC和BP组、早期PDAC和Ctr组、早期PDAC和BP组均有较显著的代谢差异。本研究中胰腺癌血清差异代谢物最显著的特点是多种脂肪酸水平上调、氨基酸水平下调、部分有机酸代谢异常、磷脂代谢异常等。基于OPLS-DA模型筛选出PDAC和Ctr组、PDAC和BP组共有的差异代谢物有22种,早期PDAC和Ctr组、早期PDAC和BP组共有的差异代谢物有29种,两者的交集有19种,主要为脂肪酸、氨基酸、部分磷脂酰胆碱和鞘磷脂。2.对这19种差异代谢物进行Lasso回归分析、逻辑回归分析、相关分析等,筛选出一组有区分PDAC和Ctr潜能的诊断标志物,为蒽贝素(Embelin)、左旋焦谷氨酸(L-Pyroglutamic acid)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl--sn-glycero-3-phosphatidylcholine),此组代谢物的AAUC、敏感度、特异度分别为0.938、87.5%、100%;它们区分早期PDAC和Ctr的AUC、敏感度、特异度分别为0.917、91.7%、80%,也有较好的诊断效能。筛选出一组有区分PDAC和BP潜能的一组代谢物为蒽贝素(Embelin)、D-脯氨酸(D-Proline)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine),AUC、敏感度、特异度分别为0.882、88.2%、83.3%,有较高的诊断效能;两组代谢物分别与CA19-9联合,区分PDAC和Ctr组的AUC、敏感度、特异度分别为1.000、100%、100%,区分PDAC和BP的AUC、敏感度、特异度分别为0.910、76.9%、100%。3.PDAC组织代谢组学结果显示利用OPLS-DA模型能很好地区分PDAC和Ctr、PDAC和BP组织、早期PDAC和Ctr组、早期PDAC和BP组,两组间存在较显著的代谢差异。本研究中胰腺癌组织差异代谢物最显著的特点是多种氨基酸水平下调、脂肪酸水平上调、核苷酸下调、糖酵解产物水平上调、三羧酸循环代谢物下调等。PDAC和Ctr组、PDAC和BP组共有的差异代谢物有62种,早期PDAC vs Ctr、早期PDAC vs BP共有的差异代谢物有42种,两者的交集有36种,主要为核苷酸类、氨基酸类、脂肪酸、磷酸胆碱以及糖代谢产物等。4.PDAC vs Ctr血清和组织重合的代谢物有27种,共有的差异代谢通路有11条,包括肿瘤中央碳代谢、蛋白消化和吸收、矿物质吸收、氨酰TRNA生物合成、γ-氨基丁酸能突触、不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸生物合成、ABC转运、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸代谢等。PDAC vs BP血清及组织共有的差异代谢物有6种,共有的差异代谢通路有7条,包括ABC转运、肿瘤中央碳代谢、肿瘤胆碱代谢、亚油酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢、脂肪酸生物合成。胰腺癌血清代谢分析筛出的代谢物L-Pyroglutamic acid、D-Proline在组织中也为差异代谢物,在PDAC组织中要明显低于非肿瘤胰腺组织。结论:1.本研究筛选出的两组PDAC血清代谢物区分PDAC和Ctr、PDAC和BP均有较高的诊断效能,与CA19-9联合有更满意的诊断效能,本组代谢物有作为PDAC补充诊断标志物的潜能。2.PDAC组织代谢组学结果显示较血清代谢组学有更显著的差异;PDAC组织代谢的改变反应了蛋白质、核酸的生物合成增加、能量需求以及细胞增殖的增加、有氧糖酵解增加。3.PDAC组织和血清两种样本差异代谢物和代谢通路一致性较高,也证实了本研究结果的真实性和可靠性。第二部分胰腺癌CT术前评估与手术及病理对照研究目的:分析本组PDAC常规CT图像特征,并评价CT与病理(手术)评估肿块大小、血管侵犯程度、有无区域淋巴结转移及远处转移的一致性。方法:1.本研究分析了 82例PDAC血清代谢组学入组患者的常规CT图像特征,包括肿块大小、形状、边界、密度、胆总管及主胰管扩张、强化方式、邻近血管侵犯、有无淋巴结转移及远处转移、邻近结构侵犯等。2.本研究对61例手术切除PDAC患者于CT动脉期、大体病理标本分别测量肿块大小,使用CT和外科手术探查两种方法分别评价PDAC动脉及静脉受侵情况,使用CT增强和组织病理学分别评价有无区域淋巴结转移和远处转移,然后使用组内相关系数评估两种方法测量肿块大小的一致性,使用kappa值评估两种方法在血管侵犯分级、有无区域淋巴结转移和远处转移方面的一致性。结果:1.82例PDAC于CT动脉期测量肿块的平均直径为3.5±1.1cm,多表现为类圆形、边界不清的实性乏血供肿块,70.7%的患者可见胰管扩张,39%患者胆总管可见扩张;65.9%的患者可见不同程度的血管侵犯,约50%的患者可见区域淋巴结转移,25.6%的患者可见远处转移;邻近结构如胃、脾脏、十二指肠、降结肠等可见侵犯。2.本研究CT动脉期测量PDAC肿瘤大小与组织离体后大体标本大小组内相关系数为0.773,有较强一致性。本研究采用血管侵犯评价三级评级法,使用CT和外科手术探查两种方法分别评价PDAC动脉及静脉受侵情况,加权kappa一致性检验结果显示,两者评价动脉及静脉受侵kappa值分别为0.756、0.759,均存在较强的一致性。CT评估PDAC淋巴结转移与病理的一致性检验结果显示kappa值为0.581,为中度一致性;CT评估PDAC远处转移与病理的一致性检验结果显示kappa值为0.871,具有高度一致性。结论:1.PDAC多表现为类圆形实性乏血供肿块,可见不同程度的血管侵犯、区域淋巴结转移和远处转移;2.CT在评估肿瘤大小、血管侵犯及远处转移方面有较高的价值,在评估区域淋巴结转移方面价值有限。第三部分胰腺癌CT特征与血清差异代谢物相关性研究目的:本研究尝试结合胰腺癌CT特征和代谢组学,宏观结合微观,探索表征胰腺癌不同分期、有无血管侵犯、淋巴结转移和远处转移的代谢物,有助于胰腺癌精准诊断及胰腺癌侵袭性机制研究。方法:1.结合CT和外科手术探查、组织病理结果对82例PDAC患者按照胰腺癌分期(早期Ⅰ、Ⅱ期、晚期Ⅲ、Ⅳ期)、有无血管侵犯、淋巴结转移、远处转移分别进行分组,并使用单变量和多变量统计方法进行分析,分别构建PCA及OPLS-DA模型,采用p<0.05和VIP>2.0的标准初步筛选组间差异代谢物。2.对筛选出的代谢物再次进行主成分分析(PCA),筛选出对以上分组最有提示意义的代谢物。使用ROC曲线、敏感度、特异度来检验差异代谢物的预测效能,使用KEGG通路数据库进行网络及通路分析。结果:本研究结合CT、外科手术探查及病理结果,使用代谢组学进一步区分胰腺癌TNM分期(早、晚期)、PDAC有无血管侵犯、有无区域淋巴结转移及远处转移等,筛查对提示以上分组有意义的代谢物,多变量分析结果显示,L-异亮氨酸可区分PDAC早期、晚期,且效能优于CA19-9,AUC为0.7812,特异性62.5%,敏感性100%;花生四烯酸与PDAC血管侵犯有一定的的相关性,AUC值为0.679,特异性85.7%,敏感性50.0%;1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱可区分有、无淋巴结转移,AUC为0.729,特异性66.7%,敏感性87.5%;L-苯丙氨酸和PDAC有无转移相关,区分PDAC有无转移的AUC值为0.745,特异性63.6%,敏感性100%。结论:结合CT进行代谢组学分析,可筛出提示PDAC分期、有无血管侵犯、有无区域淋巴结转移及远处转移的代谢物。