研究背景:随着影像医学的迅速发展,有关各类显像造影剂的研究逐渐成为影像学关注的焦点。这些造影剂不仅在增强显像效果、精准判断病变范围、推断病变性质方面起到了极大的辅助作用,也显示出辅助体内靶向治疗的巨大潜能。其中,微泡/纳米泡超声造影剂因其精准的靶向性、实时性和可视性,易于加载小分子结构和促进细胞摄取的特征,成为靶向治疗体系中最有前景的方案之一。相对于常规治疗,靶向化治疗在癌症化疗的整体疗效评价中具有十分积极地推动作用。虽然化疗药物作为恶性肿瘤的主要治疗方式能显著提高癌症患者的生存率,但很多化疗药物具有显著的副作用。如顺铂有不可逆的肾毒性、骨髓抑制性、神经毒性;卡铂有骨髓抑制性;阿霉素有显著的心脏毒性等。为降低其全身副作用,这些化疗药的使用剂量受到严格限制,其抗癌疗效亦受到限制。靶向治疗不仅能增加药物在肿瘤局部或靶位点的治疗剂量,也相应减少其在血液循环和其他组织中的浓度。这使得化疗药一方面因在肿瘤局部的聚集量而疗效增加,另一方面在全身其他组织的沉积量减少而副作用减弱。由于靶向治疗的这种优势,在其癌症治疗研究中备受关注。靶向递送系统有很多种,包括纳米粒、微胶束、脂质体等,给药途径也分为口服给药、静脉给药、鼻腔给药、microbubble 结肠给药等。超声靶向微泡破坏(Ultrasound-targeted destruction,UTMD)靶向系统的独特治疗优势体现在治疗具有实时可视性、定位更精确,靶向递送到组织的同时还能促进化疗药物进入肿瘤细胞内部。由于具有可视性、非侵入性和高度靶向性的优势,载药超声微泡作为有效的药物递送系统已进入临床应用。近期研究表明,与传统微泡相比,超声纳米泡或液滴更易穿透肿瘤新生毛细管壁,从而更为有效地输送药物到靶向肿瘤组织中。造影剂的高度生物安全性是其应用于临床的重要基础。常见超声纳米造影剂由外壳和内核两部分组成。在造影剂的制作材料中,一些高分子材料和化学材料具有潜在的生物学毒性,不仅对机体健康产生威胁,在已经开展的临床应用中也出现了因致敏导致危害生命的情况。因此寻找更为安全的生物学材料,制成能达到相应显影效果和载药能力的造影剂,是造影成像研究的基础。壳聚糖作为一类天然多糖,具有良好的生物降解性、生物相容性、极低的免疫原性、抗菌活性和实用性,同时也是地球上最丰富的生物材料之一。这类多糖已被广泛用于医用凝胶、支架和各类医用辅料,近期也有研究显示,其可用于超声微泡的制作和基因、药物的携带。水溶性壳聚糖寡聚体与IFN-γ相互作用还能够激活巨噬细胞,并通过这种方式以杀死癌细胞。因此,壳聚糖本身具有直接和间接的抗肿瘤作用,更增加了它作为抗癌药物靶向载体的优势。基于以往研究,我们以中等分子量壳聚糖为主要壳材料,联合其他生物表面活性剂,以惰性气体为核心,制作了可用于超声造影的高度生物相容性纳米造影剂。在本研究中使其负载抗癌药物模型——阿霉素进行靶向治疗,合理预想该造影剂具有高度的生物安全性、相应的超声造影能力和超声引导下靶向给药的能力。研究目的:本研究的目的是制作高度生物相容性壳聚糖造影剂,并检测其粒径、稳定性、体外细胞毒性、载药能力、显影能力、联合超声靶向介导药物进入细胞发挥抗癌作用的能力。进而应用不同物理形态的氟碳类物质作为核心制成的壳聚糖纳米超声造影剂,并对两者的表征、各项特点及在动物体内的安全性进行了对比评价。本研究期望建立具有良好生物相容性、显像能力和靶向递药能力的超声造影剂,为今后应用于临床超声造影工作奠定基础。研究方法:第一部分:生物相容性壳聚糖纳米气泡超声介导靶向给药阿霉素(1)制作壳聚糖纳米泡:我们采用震荡法制作纳米泡,超滤管离心备用。(2)通过动态光散射方法测量壳聚糖纳米泡的平均粒径、尺寸分布和所带电荷量。通过一段时间内动态光散射方法测量粒径变化及倒置显微镜下观察的方法,检测壳聚糖纳米泡的稳定性。(3)通过UV分光光度计测定壳聚糖纳米泡负载抗癌药物阿霉素的载药能力。使用透析方法体外检测在超声作用下纳米泡负载阿霉素的释放规律,并比较其与非超声作用下纳米泡药物释放的差异。(4)建立体外超声显影装置,应用临床超声成像系统对所制成壳聚糖纳米泡的超声增强显像能力进行评估。(5)应用CCK8实验在体外对空白壳聚糖纳米泡的生物安全性进行评价,并通过其在MCF-7乳腺癌细胞中的细胞毒性测定来评估。(6)通过流式细胞术测量比较相同药物浓度下,载阿霉素壳聚糖纳米泡、阿霉素壳聚糖纳米泡加超声、游离阿霉素在体外分别介导乳腺癌细胞摄取阿霉素的能力及它们不同的诱导的乳腺癌细胞凋亡的能力。(7)所有实验一式三份进行,数据表示为平均值。使用SPSS版本18.0进行统计分析。P值<0.05被认为具有统计学意义。第二部分:液态氟碳及全氟丙烷壳聚糖纳米粒的制备、表征(1)应用震荡方法制作空白全氟丙烷-壳聚糖纳米泡及全氟己烷-壳聚糖纳米滴。两种造影剂制作过程除以液态的全氟己烷替换全氟丙烷气体,其他试剂剂量及方法保持一致。(2)通过动态光散射方法测量并比较全氟丙烷-壳聚糖纳米泡(Perfluoropropane-chitosan nanobubbles PP纳米泡)和全氟己烷-壳聚糖纳米滴(Perfluorohexane-chitosan Nanodroplet PE纳米滴)的平均粒径、尺寸分布和所带电荷量。(3)应用倒置显微镜观察对比PP纳米泡与PE纳米滴在4℃及室温下分别在PBS溶液和血液中的稳定性。(4)应用临床超声扫描仪比较PP纳米泡与PE纳米滴的超声增强显像效果及稳定性。(5)所有实验一式三份进行,数据表示为平均值。使用SPSS版本18.0进行统计分析。P值<0.05被认为具有统计学意义。第三部分:PP纳米泡与PE纳米滴体内安全性的评价(1)配置相同浓度的PP纳米泡与PE纳米滴溶液。健康清洁级昆明种小鼠90只,按照给药方式和剂量的不同,随机分为9组(表1)。分别按总剂量2100mg/kg、给药容积0.8ml/每只调整药物浓度口服灌胃,给药时间为当日(8:00a.m、4:00 p.m);总剂量240 mg/kg,给药容积0.5ml/每只调整给药浓度一次腹腔注射;总剂量80mg/kg、给药容积0.5ml/每只从小鼠尾静脉一次性静脉注射。30只作为对照。(2)连续14天对给药后各组小鼠的食欲及活动状况进行观察。(3)饲养14天后从每只处死小鼠眼球采集血液,检测并比较不同给药方式中PP纳米泡、PE纳米滴组与对照组生化指标的差异,包括尿素氮、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、白蛋白、甘油三酯、胆固醇、血糖等。(4)各组实验小鼠于饲养14天后处死,随机在每组中抽取4只小鼠做解剖病理,取其心、肝、脾、肺、肾组织标本观察脏器颜色、形态,并对脏器组织进行病理切片,HE染色观察有无细胞水肿、变形、坏死发生。(5)所有实验一式三份进行,数据表示为平均值。使用SPSS版本18.0进行统计分析。P值<0.05被认为具有统计学意义。结果:第一部分.:生物相容性壳聚糖纳米气泡超声介导靶向给药阿霉素(1)制得负载阿霉素的壳聚糖纳米泡的平均直径为641nm,PI:0.256,纳米泡的平均zeta电位为+67.12±2.1 mV。载阿霉素的壳聚糖纳米泡在4℃悬浮48h粒径大小没有明显变化(p<0.05)。在室温下储存后,发现载阿霉素的壳聚糖纳米泡的在PBS和人血清中的平均粒径都略有增加。(2)负载阿霉素的壳聚糖纳米泡的最终载药量为64.12 mg/g,相当于药物包封率为54.18%。检测超声组载阿霉素的壳聚糖纳米泡与非超声组释放药物过程如图,24小时内超声组的阿霉素释放速度和释放量显著大于非超声组。(3)在阿霉素超声造影剂具有良好的增强超声显影能力,并且检测显影的15分钟内,声衰减缓慢,表明壳聚糖纳米泡的超声增强信号足以稳定用于一段时间的超声对比成像。(4)空白壳聚糖纳米泡作为体内药物载体具有高度生物安全性。当与超声联合使用时,在0.5W/cm2的超声强度和30秒的照射下,在10%纳米泡悬浮液中,MCF-7细胞的存活率为99.53%。相同超声下,20%浓度的壳聚糖纳米泡中MCF-7细胞存活率亦大于90%。(5)无超声照射时,阿霉素纳米泡组MCF-7细胞的平均荧光强度远低于用游离阿霉素组细胞的自发荧光,说明在非超声照射部位壳聚糖纳米泡减少细胞对阿霉素的摄取,从而在阿霉素体内循环过程中保护了非病变部位的组织细胞。在超声照射下,阿霉素纳米泡组细胞摄取阿霉素显着增加,而游离阿霉素组细胞摄取阿霉素仅略有增加,表明超声照射辅助下载药纳米泡可以将更多的阿霉素药物输送至MCF-7细胞内发挥作用。(6)细胞学毒性试验及流式细胞技术测量各组MCF-7细胞的活力。结果显示,非超声状态下,负载阿霉素纳米泡组MCF-7细胞活力高于游离阿霉素组。与此对应,在超声照射下负载阿霉素纳米泡组MCF-7细胞的活力则明显低于游离阿霉素组。(7)细胞凋亡实验的结果趋势与细胞毒性实验一致。在游离阿霉素组MCF-7细胞凋亡的百分比为4.4±0.9%,在超声作用后细胞凋亡比例没有明显变化。相同时间、强度的超声照射下,阿霉素纳米泡组凋亡细胞的百分比则比无照射时显著增加(3.2±0.9%对45.7±1.1%,p<0.01)。此外,未经超声照射时,纳米泡组凋亡细胞的百分比低于游离阿霉素处理组(3.2±0.9%对4.4±0.9%)。第二部分:液态氟碳及全氟丙烷壳聚糖造影剂的制备、表征(1)空白PE纳米滴平均粒径为641nm,PI:0.219;空白PP纳米泡平均粒径为762nm,PI:0.328,显著大于纳米滴的平均粒径。PE纳米滴的zeta电位为+17.89±3.47 mV,PP纳米泡的zeta电位为+18.21±4.91mV,两者无显著差异(P>0.05)。(2)倒置显微镜观察,48小时后在4℃放置的PP纳米泡与PE纳米滴粒径均没有明显变化。室温下放置6小时后,置于PBS和血清中的PP纳米泡粒径均有轻微增大,PE纳米滴粒径无明显变化。(3)对相同浓度的PP纳米泡与PE纳米滴应用临床超声诊断仪行体外显像均呈现良好的超声增强显像效果,且无明显差异。经过20min相同频率和深度的超声照射观察,PP纳米泡在显示屏上的声衰减速度略大于PE纳米滴。第三部分:PP纳米泡与PE纳米滴体内安全性的评价(1)一般情况:给药及对照组的小鼠一般情况良好,未出现死亡。静脉注射PP纳米泡及PE纳米滴组给药当日14只小鼠均出现短暂的站立不稳、食欲下降和饮水量增多,3只嗜睡,次日全部恢复正常,其余各组及对照组小鼠活动、饮食未出现异常。(2)各组小鼠的主要生化指标,包括尿素氮、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总蛋白、白蛋白、甘油三酯、胆固醇、血糖、总胆红素,在各组小鼠及对照组间均无明显差异(P>0.05)。(3)给药14天后小鼠主要脏器的病理学观察:各组小鼠的脏器大体标本形态与颜色无明显差异,均未见显著异常;各组间脏器系数无显著差别。HE染色心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏切片细胞形态及组织排列均无明显差异,无炎性细胞浸润。研究结论:我们的研究制作了生物相容性壳聚糖纳米超声造影剂,首次观察了它负载及向细胞靶向递送抗癌药物的能力,首次比较了含气态氟碳-壳聚糖纳米造影剂与含液态氟碳-壳聚糖纳米造影剂在表征和稳定性方面的差异,并对他们在生物体内的安全性进行了评估。研究结果显示,PP纳米泡具有良好的载药能力及超声下显著加强药物释放的能力。PP纳米泡超声极低的细胞毒性和高度的生物相容性,增强显影效果良好,有较长的持续显影时间。体外实验显示PP纳米泡能大幅度提高药物的细胞摄取及抗癌疗效。PE纳米滴平均粒径略小于PP纳米泡,两者所带电荷量无明显差异。PE纳米滴体外稳定性更高,超声显影效果同PP纳米泡无明显差异。动物体内实验证实PE纳米滴和PP纳米泡均未引起小鼠血生化指标及脏器组织的病理学改变,两种超声显影剂均具有高度生物安全性。研究表明应用壳聚糖纳米造影剂行超声造影是一类可以同时用于影像学诊断和靶向抗癌治疗的安全有效的方式。不足之处在于,壳聚糖纳米造影剂在动物体内显影效果及抗肿瘤治疗效果有待于研究证实。总之,生物相容性壳聚糖造影剂适用于超声靶向药物/基因的递送,作为非侵入性靶向治疗有前途的策略之一,值得进一步研究。