论文部分内容阅读
[目的]：明确基质细胞衍生因子-1(Stromal Cell Derived Factor-1,SDF-1)信号通路在关节软骨退变中的作用,探索T140(Polyphemusin II-derived peptide)体外阻断SDF-1/CXCR4信号通路延缓人关节软骨退变的可能性及其机制,为骨关节炎(osteoarthritis, OA)的体内靶向治疗提供依据。[方法]：1.取12例确诊为OA(排外关节的其它疾病)行全膝关节置换术患者软骨组织,作为OA软骨组,另取因创伤性截肢患者(正常成人,年龄18-35岁,排外关节的其它疾病)的12例膝关节软骨组织,作为正常软骨组,切取表层大小为3×3×1mm的软骨组织块(Mankin评分为0或1)作为实验对象,用外源性的SDF-1作为诱导软骨退变的条件,用CXCR4的特异性拮抗剂T140作为实验药物进行研究。将软骨块置于培养液中,于37℃5%CO2培养箱内培养2天及4天。其培养液分别为含有SDF-1和实验药物T140,MAB310, MAB002(其中SDF-1100ng/ml, T140, MAB310, MAB002均为1000nM)。每个软骨组按培养液成分分为4个小组：：①实验组：培养液中加T140+SDF-1,②实验对照组1：培养液中加MAB310+SDF-1,③实验对照组2：培养液中加MAB002+SDF-1,④空白对照组：培养液中只加SDF-1。2.将软骨组织块分别进行体外培养2天或4天后,收集软骨组织标本及培养液进行如下检测：(1)组织学检测(HE染色和番红-0染色),Mankin评分,以评估软骨的组织形态学改变；(2)ELISA测定培养液内基质金属蛋白酶-3(Matrix metalloproteinases-3, MMP-3)、-9、-13的含量,RT-PCR测定软骨组织内MMP-3、-9、-13 mRNA的表达；(3) RT-PCR测定软骨组织内Ⅱ型胶原蛋白,聚集蛋白聚糖mRNA的表达,Western blotting检测软骨组织内Ⅱ型胶原蛋白的含量。所有数据采用SPSS17.0统计软件包进行处理,各组数值用均数±标准差(X±S)表示,采用方差分析,以a=0.05作为差异有显著性的标准。[结果]：(1)组织学检测(HE和潘红-0染色)结果：1)相同软骨组培养相同时间：实验组较实验对照组1、实验对照组2和空白对照组软骨面较规则,细胞数量较量多,软骨细胞胞浆染色较为均匀,基质排列较紧密、有序,Mankin评分较低,差异有统计学意义(P<0.05),而实验对照组2和空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)；2)相同软骨组培养4天与培养2天相比：实验组染色观察和Mankin评分均无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05),而实验对照组2和空白对照组随时间延长软骨面变得不规则,细胞数量相对减少,软骨细胞胞浆染色欠均匀,基质排列较疏松、紊乱,Mankin评分升高,差异有统计学意义(P<0.05)；3)OA软骨组与正常软骨组培养相同时间比较：培养相同时间后OA软骨组各个小组均较正常软骨组相同小组细胞数量相对较少,软骨细胞胞浆染色欠均匀,基质排列较疏松、紊乱,Mankin评分较高,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)ELISA测定培养液内MMP-3、-9、-13的含量,RT-PCR测定软骨组织内MMP-3、-9、-13 mRNA的表达结果：1)相同软骨组培养相同时间比较：实验组培养液内MMP-3、-9、-13的含量和软骨组织内MMP-3、-9、-13 mRNA的表达水平均较实验对照组1、实验对照组2和空白对照组较低,差异有统计学意义(P<0.05),而实验对照组2和空白对照组,以上指标差异均无统计学意义(P>0.05)；2)相同软骨组培养4天与培养2天相比：实验组培养液内MMP-3、-9、-13的含量和软骨组织内MMP-3、-9、-13 mRNA的表达水平无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05),而实验对照组2和空白对照组以上指标均升高,差异有统计学意义(P<0.05)；3)OA软骨组与正常软骨组相比：培养相同时间后OA软骨组各个小组培养液内MMP-3、-9、-13的含量和软骨组织内MMP-3、-9、-13mRNA的表达水平均较正常软骨组相同小组高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3) RT-PCR测定软骨组织内Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA的表达,Western blotting检测软骨组织内Ⅱ型胶原蛋白的含量结果：1)相同软骨组培养相同时间比较：实验组软骨组织内Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA的表达水平和Ⅱ型胶原蛋白的含量均较实验对照组1,实验对照组2和空白对照组高,差异有统计学意义(P<0.05),而实验对照组2和空白对照组相比,以上指标差异均无统计学意义(P>0.05)；2)相同软骨组培养4天较培养2天相比：实验组软骨组织内Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA的表达水平和Ⅱ型胶原蛋白的含量均无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05),而实验对照组2和空白对照组以上指标均较高,差异有统计学意义(P<0.05)；3)OA软骨组与正常软骨组相比：培养相同时间OA软骨组各个小组软骨组织内Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA的表达水平和Ⅱ型胶原蛋白的含量均较正常软骨相同小组高,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]：1.体外培养人关节软骨过程中加入SDF-1可诱导关节软骨退变。2.T140可体外阻断SDF-1/CXCR4信号通路延缓关节软骨退变。3.T140短期内只能延缓关节软骨退变,而不能使己退变的OA关节软骨逆转为正常的关节软骨。