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第一部分建立多重PCR方法检测八种人类疱疹病毒【目的】建立能同时扩增八种人类疱疹病毒的多重PCR方法。【方法】通过NCBI数据库找到八种疱疹病毒的保守序列,基于这些保守序列运用软件进行疱疹病毒引物探针的设计,将设计好的引物探针进行可行性验证,经过对PCR反应体系和条件的优化,建立稳定的多重PCR扩增方法。随机选取造血干细胞移植后患者的外周血标本200份,采用Lab-Aid824核酸提取Mini试剂抽取全基因组DNA,建立的多重PCR方法对八种疱疹病毒同时进行扩增。对HSV-1、HSV-2、EBV、CMV四种疱疹病毒,采用与已有的国际标准品比对的方法进行特异性检验,对目前没有国际标准品的VZV、HHV-6、HHV-7、HHV-8四种疱疹病毒,则采用一代测序的方法进行特异性检验。采用不同浓度的质控品对已建立的多重PCR方法进行敏感性检验。【结果】(1)成功设计多重PCR的引物探针,建立稳定的多重PCR反应体系,同时扩增八种人类疱疹病毒,扩增条件通过优化后,提高了扩增效率。(2)多重PCR方法与目前已有的单一疱疹病毒检测试剂盒对HSV-1、HSV-2、EBV、CMV四种疱疹病毒的检测结果比较,差异无统计学意义(P>0.05)。VZV、HHV-6、HHV-7、HHV-8四种疱疹病毒,多重PCR方法扩增的阳性样本产物进一步行一代测序,经过序列比对显示扩增序列为此四种疱疹病毒的序列,该方法具有较强的特异性。(3)将合成的质控品分别稀释成1x105、1x104以及1x103的拷贝数进行敏感度检验,显示多重PCR方法可以检测出低于1x103的样本,该方法具有较高的敏感度。【结论】建立的多重PCR方法可同时扩增并鉴别八种人类疱疹病毒,具有较强的特异性和较高的敏感度。第二部分造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染的临床研究【目的】应用多重PCR方法同时检测八种人类疱疹病毒,分析造血干细胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)90天内八种人类疱疹病毒的感染状况,并探讨造血干细胞移植后多种疱疹病毒感染与临床因素的相关性及其对移植后并发症和预后的影响。【方法】以苏州大学附属第一医院血液科2017年2月~2017年8月行HSCT的90例患者为研究对象,收集其移植预处理前和移植后90天内不同时间点的外周血标本共734份,Lab-Aid824核酸提取Mini试剂抽提全基因组DNA,应用多重PCR方法同时扩增八种人类疱疹病毒,分析造血干细胞移植前和移植后早期单一和多种疱疹病毒感染的状况,并采用多种统计方法分析移植后早期多种疱疹病毒感染与临床因素的相关性及其对移植后并发症和预后的影响。【结果】(1)90例患者中男53例,女37例,中位年龄为29.9(9~51)岁。至随访终点,中位随访时间为192(35~308)天;发生0-Ⅰ度a GVHD的患者有58例(64.4%),发生Ⅱ-Ⅳ度a GVHD的患者有32例(35.6%);粒系植入中位时间为12(8~23)天,巨核系植入中位时间为14(9~36)天;HSCT后患者的总体生存(OS)率为90.6%,移植后复发率为11.7%,无疾病进展生存(PFS)率为88.3%,移植后非复发死亡(NRM)率为5.6%。(2)90例患者中,造血干细胞移植前疱疹病毒感染发生率为35.6%(32/90),其中1种病毒感染发生率为12.2%(11/90),多种病毒感染发生率为23.3%(21/90)。HSV-1,HSV-2,VZV,EBV,CMV,HHV-6,HHV-7,HHV-8的样本检出率分别为20%(18/90),4.4%(4/90),3.3%(3/90),26.7%(24/90),5.6%(5/90),4.4%(4/90),2.2%(2/90),3.3%(3/90),同时检出多种疱疹病毒的样本检出率为23.3%(21/90)。造血干细胞移植后早期HSV-1,HSV-2,VZV,EBV,CMV,HHV-6,HHV-7,HHV-8的样本检出率分别是12.4%(80/644),1.6%(10/644),1.7%(11/644),20.5%(132/644),17.4%(112/644),5.7%(37/644),2.2%(14/644),1.4%(9/644),同时检出2种病毒的样本检出率为8.3%(62/644),同时检出3种病毒的样本检出率为1.7%(11/644),相同样本未同时检出4种疱疹病毒。90例患者中,移植后疱疹病毒感染发生率为77.8%(70/90),其中1种疱疹病毒感染发生率为20%(18/90),多种疱疹病毒感染发生率为57.8%(52/90)。在多种疱疹病毒感染的患者中2种病毒感染的有30例(57.7%),3种病毒感染的有18例(34.6%),4种病毒感染的有4例(7.7%)。(3)造血干细胞移植后34例患者出现病毒感染相关的临床表现,主要为出血性膀胱炎(HC)的有27例,间质性肺炎的有3例,肠炎的有2例,病毒性脑炎的有3例,不明原因发热的有3例。其中27例HC患者中,有2例合并有间质性肺炎,1例合并有病毒性脑炎,1例合并有不明原因发热。27例HC患者中有20例患者检出疱疹病毒感染,其中4例检出单一病毒感染,16例检出多种病毒感染;发生间质性肺炎的3例患者均检出多种疱疹病毒感染;发生肠炎的2例患者也均检出多种疱疹病毒感染;3例病毒性脑炎的患者中,2例检出疱疹病毒感染;3例不明原因发热的患者中,2例检出疱疹病毒感染。(4)我们分析了八种疱疹病毒间发生感染的相关性,结果显示HSV-1和HSV-2两种病毒感染存在相关性(r=-0.279,P=0.046);HHV-6和HHV-7两种病毒感染也存在相关性(r=0.381,P=0.007)。分析了患者的年龄,性别,疾病类型,发病时间等临床因素与移植前八种疱疹病毒感染的相关性,结果显示移植前患者的年龄与HSV-1感染发生具有一定的相关性(r=0.44,P=0.035),移植前其他的单一疱疹病毒感染和多种疱疹病毒感染均未统计出与临床因素存在明显的相关性(P>0.05)。分析了供受体年龄,性别,血型,HLA配型,受体疾病类型,预处理方式,II-IV度a GVHD等因素与移植后常见单一疱疹病毒感染(HSV-1,EBV,CMV,HHV6)及多种疱疹病毒感染的相关性,结果显示常见单一疱疹病毒感染均未见与临床因素存在相关性,≥2种疱疹病毒感染与HLA不全相合(P=0.003),使用ATG(P=0.048)和II-IV度a GVHD(P=0.022)呈正相关。多因素分析显示HLA不全相合(P=0.003,OR=7.572,95%CI:2.029-28.255)和II-IV度a GVHD(P=0.016,OR=6.415,95%CI:1.422-29.264)是≥2种疱疹病毒感染发生的独立危险因素。(5)我们分析了移植后常见单一疱疹病毒感染和≥2种疱疹病毒感染对移植后植入,II-IV度a GVHD,复发,NRM,PFS和OS的影响。结果显示≥2种疱疹病毒感染(P=0.028)和伴有HHV-6感染(P=0.006)均可增加II-IV度a GVHD发生率。【结论】造血干细胞移植前后均存在一种和多种疱疹病毒感染;其中HSV-1和HSV-2,HHV-6和HHV-7病毒感染两两间存在一定的相关性;HLA不全相合和II-IV度a GVHD增加了≥2种疱疹病毒感染发生率,而伴有HHV-6感染和≥2种疱疹病毒感染可增加II-IV度a GVHD发生率。