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目的:铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo来源于兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）,作为我国传统的名贵中药材,具有益胃生津、滋阴清热等功效。主要有效成分为石斛类多糖、生物碱、酚类、氨基酸等,现代医学研究表明,铁皮石斛具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、降血糖和有效减轻肝损伤等作用。野生铁皮石斛生长缓慢、自然繁殖能力极低,由于近年来过度采挖和生态环境的不断破坏,资源濒临灭绝。人工栽培铁皮石斛的种植模式成为产业化的必然趋势。在铁皮石斛人工种植区,病虫害较为严重,大大降低其产量及品质。经调查发现,炭疽病在铁皮石斛种植区最为普遍、危害严重,且传染性强,防治较为困难,严重影响铁皮石斛药材的产量和质量。对于炭疽病的防治,目前采取的措施主要为改善栽培环境、药物防治等。因尚无对炭疽病等病害免疫的品种,而化学防治导致农药残留和病原菌耐药性等问题日益突出。加上育种技术研究滞后,缺乏优良、抗病新品种,导致铁皮石斛产业发展缓慢。采用现代育种技术加速铁皮石斛抗病新品种选育进程已迫在眉睫。因此,本研究应用EMS（Ethyl methane sulfonste,甲基磺酸乙酯）诱变育种方式,结合RNA-seq技术研究铁皮石斛抗炭疽病病原菌的抗病机理初步研究,以期为今后培育铁皮石斛抗病新品种奠定一定的基础。方法:本研究应用EMS诱变铁皮石斛原球茎,结合病原菌粗毒素进行铁皮石斛抗性苗的筛选,并采用RNA-seq技术对铁皮石斛感炭疽病前后的基因表达差异展开研究,以研究铁皮石斛防御胶孢炭疽菌侵染的机理过程。具体工作包括:1.对铁皮石斛原球茎做不同浓度及不同时间的EMS诱变处理,根据存活率得LD50值,结合变异情况确定其适宜诱变浓度,并应用ISSR-PCR从分子水平检测变异情况;对病原菌接种方法进行筛选,将病原菌接种于铁皮石斛EMS诱变移栽苗,检测EMS诱变突变体对于胶孢炭疽菌的抗病性,筛选铁皮石斛抗病突变体;2.探究胶孢炭疽菌粗毒素对铁皮石斛生长的影响,利用铁皮石斛正常组培苗以不同浓度的胶孢炭疽菌粗毒素为选择压力进行抗性诱导和筛选,以筛选出的抗性浓度应用于EMS诱变铁皮石斛原球茎,筛选出EMS诱变突变体对于胶孢炭疽菌粗毒素抗性选择压下的铁皮石斛抗病性苗;3.用针刺接种法将胶孢炭疽菌的孢子悬浮液接种于铁皮石斛正常移栽苗,得到三个不同感病阶段的叶片样本,利用RNA-seq技术对侵染前后的铁皮石斛叶片进行转录组学研究,探究胶孢炭疽菌侵染铁皮石斛前后的基因与代谢差异及其抗病机制。结果:1.对铁皮石斛原球茎做不同EMS诱变浓度及不同诱变时间的处理,得出死亡率最接近半数致死量的处理组合是EMS浓度1.0%诱变处理6h,可以作为EMS诱变铁皮石斛适宜的诱变处理;且通过性状观察和ISSR-PCR检测,铁皮石斛经EMS诱变后出现不同变异形态且遗传相似系数较大,可获得较高的变异率;通过对病原菌接种方法的筛选,得出针刺法接种胶孢炭疽菌孢子悬浮液的方法对铁皮石斛可造成病原菌感染,可用来检测EMS诱变铁皮石斛幼苗的抗病性;选取了9组变异幼苗,与对照组幼苗一同接种胶孢炭疽菌孢子悬浮液,结果显示变异植株比对照组植株抗病性多具有一定的提高,说明EMS诱变铁皮石斛可用于抗性植株的育种和培育进程。2.胶孢炭疽菌粗毒素对铁皮石斛原球茎的生长影响研究表明,炭疽菌粗毒素具有一定的生物活性和毒力,可代替病原菌对植株进行抗性筛选研究;当胶孢炭疽菌粗毒素体积浓度为40%（C8组）时,铁皮石斛原球茎死亡率最高,且幼苗出现萎黄、枯萎现象,且各组生理数据的LSD多重对比结果显示,C8组在培养一定时间后,幼苗长势较其它组均较差,故综合考虑,C8可作为抗性选择压;利用此抗性选择压,与EMS诱变铁皮石斛相结合,可获得抗性具有一定提高的植株。3.采用针刺接种法对健康铁皮石斛叶片进行病原菌的孢子悬浮液接种,根据侵染速度和侵染程度,选取了侵染后7d、14d和21d时的感病叶片样本;利用RNA-Seq技术,对铁皮石斛健康叶片以及侵染后的三个不同阶段样本进行研究,结果显示,随着炭疽菌侵染寄主感病程度的增加,差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）显著增加;在侵染第三阶段时,与对照组的显著性DEGs多达1175个（DC0-DC3）,并对这些DEGs进行了GO功能与KEGG通路的富集分析。这些数据表明,铁皮石斛在受到胶孢炭疽菌侵染后,调动了复杂的网络调节机制,从而使自身能更快速的适应并应对炭疽菌的侵染胁迫。结论:本研究通过对铁皮石斛原球茎的EMS诱变处理,性状观察和分子检测方法均确定EMS诱变用于铁皮石斛诱变育种的有效性和可靠性,并能从中筛选出具有一定抗病性的铁皮石斛植株;同时通过胶孢炭疽菌粗毒素应用于铁皮石斛组织培养基以及EMS诱变相结合的方法,也可获得铁皮石斛抗性提高的植株;利用RNA-Seq技术对胶孢炭疽菌侵染铁皮石斛前后的样本进行差异基因研究,初步了解铁皮石斛为应对胶孢炭疽菌侵染的防御机制。本研究综合铁皮石斛EMS诱变育种与植株防御病原菌侵染的机制研究,以期为铁皮石斛抗病育种和培育新品种进程提供一定的研究基础。