研究目的通过建立尾悬吊(tail suspension,TS)、脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)等两种雄性小鼠骨质疏松模型,观察GPER及其配体以及阳性对照雌激素对小鼠骨质疏松的影响,并探讨其可能存在的分子作用机制,为促进GPER在临床骨代谢相关疾病的运用奠定基础。作为一种研究废用性骨质疏松模型的方法,尾悬吊法能够有效地诱导小鼠出现稳定、显著的骨质流失表现。首先我们利用自制的小鼠尾悬吊装置,建立了一种雄性C57小鼠骨质疏松模型,来观察尾悬吊对雄性小鼠骨代谢的影响。接着为了明确雌激素在尾悬吊导致小鼠骨质疏松模型中的作用,我们使用兽用雌二醇及雌激素受体抑制剂对骨质疏松小鼠进行干预,观察雌激素在骨质疏松过程中的作用。随后,我们对GPER及其配体在雄性小鼠骨质疏松的影响进行较为系统性地研究,并与雌激素的作用相比较,探讨GPER在抗雄性小鼠骨质疏松过程中可能存在的作用机制。最后,我们观察了GPER及其配体在SCI导致的小鼠骨质疏松过程中的作用,探讨其用于治疗废用性骨质疏松的可能性。本课题通过对GPER及其配体作用和机制的研究,有利于未来开展男性骨质疏松症的临床治疗和预防,为开发新型抗骨质疏松药物提供新思路。研究方法1.建立一种简便易行的雄性小鼠尾悬吊骨质疏松模型建立适当的骨质疏松动物模型,可以避免实验研究对人体造成的伤害,还能在较短的时间模拟疾病病理状态。尾悬吊法是研究瘫痪、骨折等患者及航天员失重状态下出现骨质疏松的重要方法。研究发现,C57背景的小鼠悬吊后骨质流失个体差异性最小,对悬吊最敏感,是一种良好的适合用于建立骨质疏松模型的动物品种。本课题在前人的基础上,设计了一种小鼠尾悬吊装置,试图建立稳定、有效的骨质疏松模型。2.雌激素与雄性小鼠骨质疏松相关性的研究作为一种公认的抗骨质疏松药物,雌激素在绝经后骨质疏松以及卵巢切除引起的骨质疏松中发挥了关键作用。而男性骨质疏松具有其性别特点,不同于女性,雌激素在此方面的研究还非常有限。本课题在前期建立的尾悬吊骨质疏松模型基础上,通过运用雌激素以及经典雌激素受体相关抑制剂ICI182,780,探讨雌激素对雄性小鼠骨质疏松的影响及其可能存在的作用机制。3.GPER在尾悬吊小鼠骨质疏松模型中的作用研究前期我们证实E2能够有效抑制雄性小鼠骨质疏松过程,但是考虑到雌激素在雄性体内存在的副作用,选择性雌激素受体调节剂在临床的运用为此提供了一个新的思路。研究发现,GPER能够不依赖于经典的雌激素受体而发挥类雌激素效应。这为探讨GPER在尾悬吊导致的雄性小鼠骨质疏松的运用奠定了基础,通过设立E2的阳性对照,对GPER对尾悬吊致雄性小鼠骨质疏松的影响以及作用机制进行探讨。4.脊髓损伤模型的建立以及与骨质疏松相关性研究动物实验发现,GPER在尾悬吊致雄性小鼠骨质疏松模型中并无显著的抗骨质疏松效应,临床更为常见的是脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)导致的废用性骨质疏松。因此,在前人建立的钳夹伤SCI模型基础上,我们运用GPER及其配体,与阳性对照药E2进行比较,探讨GPER在脊髓损伤导致骨质疏松中的作用及其机制,并对SCI和尾悬吊致骨质疏松这两种模型进行分析比较。研究结果1.本文自制了一种小鼠尾悬吊装置,建立了雄性小鼠骨质疏松模型,通过观察和记录小鼠尾悬吊后股骨骨质疏松情况,发现雄性C57小鼠尾悬吊14d能够出现显著的骨质流失表现,解除尾悬吊后骨质流失表现并未完全恢复。两尾悬吊组在骨结构参数以及生物力学指标方面较各自对照组均显著下降,形态学方面,成骨细胞数较对照组低47.76%和41.44%,破骨细胞数较对照组高30.06%和16.93%,生长板厚度以及软骨细胞数等未见显著异常。该模型具有造模时间短,效果明显、作用稳定等特点。2.尾悬吊导致的雄性小鼠骨质疏松模型中,雌激素干预能抑制骨质流失,雌激素组多数骨相关参数与对照组相比,差异无统计学意义。而使用雌激素受体拮抗剂ICI182,780之后,雌激素的骨保护效应消失,与模型组相比差异无统计学意义。尾悬吊两周导致股骨远端离子型谷氨酸受体NMDA亚型NR2A表达降低以及与骨形成相关的Runx2蛋白水平升高,雌激素干预能够升高骨组织中NR2A以及Runx2表达水平。因此,雌激素可能通过参与激活骨组织中NRDA受体2A的表达升高,在维持小鼠长骨骨量以及抑制骨质流失方面具有良好的效果。3.GPER的配体G1、G15对改善骨质流失并无显著的作用,与模型组相比,差异无统计学意义,E2能够有效保存骨质和骨容量,对于改善尾悬吊后骨质流失情况具有良好的作用,其骨相关参数与对照组相比,并无显著统计学差异。GPER的拮抗剂G15能够促进长骨生长板处软骨细胞增殖,进而影响股骨的长度,但是G1无此效应,GPER激活在尾悬吊致小鼠骨质疏松过程中未发挥功能性作用。4.使用钳夹法建立一种中度损伤的小鼠SCI模型,G1能够抑制神经元细胞凋亡,保护神经纤维,减轻局部组织的水肿,从而发挥类雌激素效应达到神经保护作用,其效应与阳性对照药物E2相比,差异无统计学意义,进而使用GPER抑制剂G15对G1及E2组进行干预,发现G1作用发挥过程并不依赖于经典的雌激素及其受体。但是GPER及E2对SCI导致的骨质疏松并无显著治疗效果,大多数小鼠骨质参数及生物力学指标并无出现显著变化。与尾悬吊法相比,SCI能够引起小鼠后肢瘫痪致继发性骨质疏松,但是此过程操作复杂,难以量化,且受到诸多影响因素的影响,不利于建立一种快速量化和标准化的骨质疏松模型。研究结论本课题通过研究,发现小鼠尾悬吊模型是一种更加简便、快捷和能够量化的废用性骨质疏松模型方式,因此更加适用于对小鼠骨质疏松的观察和研究。在雄性小鼠骨质疏松模型中,E2能够发挥较好的抗骨质疏松效应,且这一过程可能是通过调节NR2A的表达来实现的。但是在尾悬吊导致雄鼠骨质疏松过程中,与E2同等剂量的G1,并没有表现出显著的抗骨质疏松效应,而应用G15能够有效地促进生长板部位软骨细胞的增殖,从而促进小鼠股骨的生长。通过建立雄性C57小鼠脊髓损伤模型,发现与同等剂量的雌激素相比,GPER激活后能够发挥类雌激素样效应,促进SCI后小鼠运动功能恢复。上述结果表明,与经典的雌激素类似,GPER激活在雄性骨质疏松小鼠中具有良好的神经保护效应,但是在两种不同类型的小鼠骨质疏松模型中,与雌激素同等剂量的G1均未表现出显著的抑制骨质流失效应,但是运用GPER抑制剂G15能够促进长骨生长和软骨细胞增殖。本课题通过对GPER在雄性小鼠骨质疏松模型中作用的研究,为GPER在代谢性骨病的运用提供了新的思路。