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ω-3脂肪酸脱饱和酶(ω-3 fatty acid desaturase,ω3Des)是长链多不饱和脂肪酸(long-chain polyunsaturated fatty acids,LC-PUFAs)合成途径的关键酶,可以催化从C16到C20的多种ω-6多不饱和脂肪酸转化为ω-3多不饱和脂肪酸。近年来越来越多文献报道了不同来源的ω3Des,包括酵母、微藻、霉菌等在内,可在生物体内生产LC-PUFAs。以往的研究表明,产油微生物中的ω3Des对各种脂肪酸底物的催化活性存在显著差异。ω3Des的底物选择性直接决定了生物体内ω-6和ω-3脂肪酸的分布,导致ω-6和ω-3脂肪酸组成和比例相差很大。相比于研究比较成熟且完成晶体结构解析的Δ9脂肪酸脱饱和酶(Δ9 fatty acid desaturase,Δ9Des),调控ω3Des底物选择性的分子机制仍没有定论。为了探究调控ω3Des底物选择性的分子机制及生物转化LC-PUFAs差异的原因,本研究首先应用多种生物信息学工具,筛选并得到4个候选ω3Des基因,完成了对其生物进化、跨膜结构和拓扑结构分析。随后以具有不同底物选择性的高山被孢霉(Mortierella alpina,M.alpina)和丛枝菌根真菌(Rhizophagus irregularis,R.irregularis)来源的ω3Des基因为基础,研究了ω3Des的功能,完成了对其底物选择性的验证,并通过构建12个重组嵌合酶,定位了影响ω3Des底物选择性的关键结构域。最后利用生物信息学方法对ω3Des关键结构域内和结构域外的保守氨基酸的分布情况进行比较分析,通过定点突变技术分别构建一系列突变体,并在酿酒酵母表达系统中进行功能验证;同时借助同源建模和分子对接技术,对影响ω3Des底物选择性的关键位点进行分析,以阐明调控ω3Des底物选择性的分子机制以及产油微生物转化LC-PUFAs差异的内在原因。本研究主要结果如下:1.将多种来源的ω3Des在酿酒酵母中异源表达,在培养基中添加ω-6脂肪酸底物对生长后发酵液和菌体的脂肪酸组成进行分析以研究其底物选择性,筛选并获得了2个候选ω3Des。以来源于瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum,P.aphanidermatum)中的oPaFADS17基因为模板,基于ω3Des基因的保守序列特征,筛选并合成了4个候选ω3Des基因,分别构建酿酒酵母表达载体,诱导后成功表达了oAcFADS17、oBgFADS17、oObFADS17和oRiFADS17蛋白。分析重组酵母发酵液和菌体的脂肪酸组成,结果显示oRiFADS17和oObFADS17两个候选蛋白具有脂肪酸脱饱和酶功能,其中oRiFADS17综合催化能力显著优于已报道的Δ17Des,对DGLA和AA转化率分别达到了61.8%和58.5%,重组酵母中ω-3脂肪酸含量显著增加。同时,本研究首次发现在海洋软体动物中存在脂肪酸脱饱和酶(oObFADS17)。2.基于结构域交换技术构建了12个ω3Des重组嵌合酶并进行异源表达,对酵母重组菌脂肪酸组成分析结果显示,该酶的His I区和His II区之间的片段是影响ω3Des底物选择性的关键结构域。基于氨基酸序列相似度和同源性考虑,选择来源于丛枝菌根真菌中的oRiFADS17和来源于高山被孢霉中的FADS15为亲本蛋白,通过结构域交换技术,将FADS15与oRiFADS17的氨基酸序列划分成6个片段,利用重叠延伸PCR技术融合构建了12个重组嵌合酶Chimera 1-12。在酿酒酵母中进行异源表达及功能检验,结果显示重组嵌合酶Chimera 3和Chimera 9对ω-6脂肪酸的底物转化率显著改变,表明His I区和His II区之间的片段对ω3Des的底物选择性有重要影响。3.对ω3Des关键结构域内氨基酸位点的分析结果显示,W129和T144氨基酸位点对调控ω3Des底物选择性有重要影响。基于ω3Des多序列比对和拓扑结构等信息,对来源于高山被孢霉中的FADS15和来源于丛枝菌根真菌中的oRiFADS17关键结构域内的36个氨基酸残基进行保守性分析,选择了结构域内的6个完全保守氨基酸位点和4个相对保守氨基酸位点进行定点突变,结果显示S118、N124和G128这3个完全保守氨基酸位点对ω3Des催化活性有重要影响,V137和V152氨基酸位点对ω3Des底物的识别起重要作用,W129和T144氨基酸位点对ω3Des底物选择性起关键作用。同源建模和分子对接分析进一步证明了W129和T144氨基酸位点是调控ω3Des底物选择性的关键氨基酸位点,推测W129位点的突变直接作用于底物的脂肪酸部分,降低了底物进入催化活性中心的空间位阻(T144与之相反),为脂肪酸底物进入底物通道或从底物通道中释放创造了更多的空间,使得长链脂肪酸底物AA在底物通道中进出更有效,从而导致ω3Des底物选择性的改变。4.对ω3Des关键结构域外氨基酸位点的分析结果显示,A44、M156和W291氨基酸位点对调控ω3Des底物选择性有重要影响。基于ω3Des多序列比对和拓扑结构分析结果等信息,以来源于高山被孢霉中的FADS15和瓜果腐霉中的oPaFADS17为亲本蛋白,对其全序列氨基酸进行保守性分析,选择相对保守的8个氨基酸位点进行定点突变,结果显示A44S、M156I和W291M这3个位点氨基酸的替换导致ω3Des底物选择性发生显著改变;对这3个位点进行累积突变,构建累积突变体A44S/M156I、A44S/W291M、M156I/W291M和A44S/M156I/W291M,结果显示这些位点之间并没有协同效应;对oPaFADS17氨基酸序列上相对应的3个位点进行反向突变,构建S21A、I137M和M236W突变体,结果显示这3个位点对oPaFADS17的催化活性有更显著影响。同源建模和分子对接分析结果显示这3个位点与底物的辅酶A(Coenzyme A,CoA)载体部分相邻,推测这3个位点作用于底物的CoA载体部分,影响了CoA载体的定位,间接改变了底物进入催化活性中心的角度和深度,这些氨基酸位点的差异是造成ω3Des底物选择性改变的内在原因。