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本文以条斑紫菜(Porphyrayezoensis)为原料,提取不同溶解性蛋白质后进行酶解并对酶解条件进行优化,获得对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有显著抗菌作用的酶解物备后续使用。 将上述获得的酶解物应用超滤、Sephadex C-25离子交换层析、Sephadex G-25分子筛层析、毛细管高效液相色谱以及质谱分析进行分离纯化、测序,在此基础上固相合成抗菌肽,并对该抗菌肽的主要理化性质以及抗菌机理进行研究。 研究结论如下: 1.条斑紫菜蛋白质提取及酶解条件优化 将提取的水溶性、酸溶性、盐溶性和碱溶性蛋白质分别用6种酶进行酶解,将所得24种酶解物采用琼脂孔穴扩散法对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、四联微球菌(Micrococcus tetragenus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及大肠杆菌(Escherichia coli)四种细菌进行抗菌活性测定。其中,水溶性蛋白质在硫酸铵饱和度为40-50%时沉淀所得蛋白质的胃蛋白酶酶解物中分子量小于5 KD的级分,对金黄色葡萄球菌抗菌效果最为明显。最优酶解条件为温度40℃、加酶量2%、pH1.5、时间2h。 2.条斑紫菜抗菌肽的纯化、测序及固相合成 经超滤、层析纯化得到的组份进行混合质谱鉴定,从中筛选出具有最佳抗菌活性的多肽序列TPDSEAL,分子量为732Da,等电点为pH5.34。通过APD数据库进行分析和比对,发现与其同源性最高的5种抗菌肽AP01211、AP01344、AP02431、AP01212、AP01210相似度均在45%以下。采用固相合成法,该抗菌肽已经成功合成。 3.条斑紫菜抗菌肽的理化性质及作用机理研究 理化性质: 1.对介质pH及温度变化、紫外线处理都较为稳定。 2.吸水性强,宜干燥保存;吸油率较好,可添加到香肠等肉类制品以及油饼等高油食品中,使产品组织细腻口感好,同时起到防腐保鲜作用。 作用机理: ①抗菌肽显著抑制金黄色葡萄球菌生长,致使其生长不能出现正常的对数生长期。 ②随着培养时间的延长,培养液中碱性磷酸酶的含量、蛋白质含量、β-半乳糖苷酶的含量和电导率值逐渐增加,推测可能由于抗菌肽作用致使细胞破损,细胞的通透性增强,从而导致胞内物质严重外流。 ③扫描电镜下,金黄色葡萄球菌的菌体最初是光滑、均匀、饱满的;经抗菌肽处理后的菌体表面模糊、菌体不规则;随时间培养时间延长,细胞壁出现破损,细胞壁发生粘连,胞内物质外流,视野内菌体呈模糊状。 ④透射电镜下,正常的菌体质壁结合紧密,菌体规则、圆滑,胞内物质分布均匀;经抗菌肽处理后,可见明显质壁分离、细胞质固缩,内部出现空腔或菌体破裂,内容物流出,菌体裂解死亡。