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目的β肾上腺素受体激动剂(简称β受体激动剂)在食品中的非法添加一直是影响中国居民健康的热点问题之一,尤其多种β受体激动剂的混合使用以及新型结构类似物的出现,引起居民对食品安全问题的恐慌,并且增加了市场监管的难度。因此,β受体激动剂多残留快速检测技术成为社会发展的新需求。该研究主要利用分子对接技术将人工表达的β2肾上腺素受体(β2 adrenergic receptor,β2AR)和热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)与β受体激动剂分别进行分子对接,比较他们结合能力的差异性,探索HSP27用于β受体激动剂多残留检测的可能性。方法1.将HSP27和β2AR分别与β受体激动剂类小分子药物进行分子对接,比较它们与β受体激动剂类小分子药物结合能力的差异性。2.将β2AR基因转入大肠杆菌BL21,表达出具有功能活性的β2AR蛋白,对诱导表达条件进行优化,并对表达的β2AR蛋白进行纯化。3.将HSP27基因转入大肠杆菌BL21,表达出具有功能活性的HSP27蛋白,对诱导表达条件进行优化,并对表达的HSP27蛋白进行纯化。4.ELISA方法对β2AR和HSP27与β受体激动剂类小分子药物结合能力进行验证。5.将HSP27用于检测3种β受体激动剂类小分子药物,建立标准曲线,计算检出限值,探索HSP27用于β受体激动剂多残留检测方面的可能性。结果1.分子对接结果克伦特罗、莱克多巴胺和非诺特罗三种β受体激动剂分别与HSP27和β2AR的对接模型图显示:在其形成的“配基结合小袋”中,HSP27和β2AR与β受体激动剂类小分子药物依靠疏水键和氢键相互作用。15组对接结果中9组HSP27的分子对接总评分值高于β2AR。配对t检验分析它们结合能力的差异性具有统计学意义(P=0.03)。2.β2AR蛋白的表达与纯化结果重组β2AR基因在大肠杆菌BL21中成功表达出β2AR蛋白,蛋白大小为47KD左右,诱导表达条件:在细菌生长对数期(OD=0.60.9)加入浓度为1.0mmol/L的IPTG,37℃,220 r/min,振荡培养16 h。经超声破碎、离心后留取上清,在浓度为300 mmol/L咪唑洗脱液下纯化出蛋白。3.HSP27蛋白的表达与纯化结果HSP27基因在大肠杆菌BL21中成功表达出HSP27蛋白,蛋白大小为27 KD左右,诱导表达条件:在细菌生长对数期(OD=0.60.9)加入浓度为0.8 mmol/L的IPTG,37℃,220 r/min,振荡培养16 h。经超声破碎、离心后留取上清,在浓度为250 mmol/L咪唑洗脱液下纯化出蛋白。4.ELISA活性鉴定结果ELISA方法进行其活性鉴定,结果表明:HSP27蛋白和β2AR蛋白与克伦特罗、莱克多巴胺和非诺特罗三种β受体激动剂的酶标记物均能够发生特异性反应,HSP27的OD值分别为0.685,0.662和0.525。β2AR的OD值分别为0.448、0.320和0.362。5.HSP27在β受体激动剂检测方面的应用HSP27用于3种β受体激动剂类药物检测的结果显示,在1μg/L1000μg/L范围内,HSP27与3种β受体激动剂具有较好的线性关系,莱克多巴胺和非诺特罗与克伦特罗交叉反应率分别为52.6%和29.7%,检出限值为1.53μg/L。克伦特罗、莱克多巴胺和非诺特罗的添加回收率范围分别为52.7%77.3%,51.7%71.3%和52%76.8%,重复试验中变异系数均小于15%,表明HSP27在3种β受体激动剂类药物检测中具有较好的重复性。结论通过分子对接技术,本研究发现HSP27与β受体激动剂具有较强的结合能力,并发现HSP27在β受体激动剂的多残留检测方面的作用,为β受体激动剂的多残留检测技术的建立提供新的思路和理论依据。