种内或种群内的性选择(sexual selection)和性隔离(sexual isolation)是物种形成(speciation)的重要原因。成功的交配取决于配偶之间的互动，求偶行为性状的改变使交配失败，进而导致性隔离，从而加速了物种形成。果蝇的求偶是一个本能的复杂过程，其中涉及视觉、化学和声学刺激。在求偶过程中，雄性和雌性果蝇互相发出并接受求偶的信号，进而相互取得互动。果蝇的求偶行为显示出高度的多样性。大多数果蝇物种的求偶行为是预交配求偶(precopulatory courtship)，求偶行为出现在骑乘(mounting)之前；然而少数果蝇物种的求偶行为出现在骑乘之后，被称为交配求偶(copulatory courtship)。雄性的求偶歌(courtship song)是果蝇的主要声学刺激，它是通过拍动翅膀产生的。在大部分表现预交配求偶的物种中，具有物种特异性的脉冲歌(pulse song)是实现成功交配非常重要的求偶信号。林氏果蝇(Drosophila lini)，大西氏果蝇(Drosophila ohnishii和小熊氏果蝇(Drosophila ogumai)是属于山果蝇种亚群(montium speceis-subgroup)吉川氏果蝇复合种组(kikkawai species-complex)中D.lini进化枝的三个姐妹种。其中，D.lini和D.ogumai是异地种：D.lini分布在台湾和华南地区；D.ogumai分布于缅甸南部；D.ohnishii分布于它们的中间地带，在缅甸中部和云南的西双版纳。它们的形态非常相似，尤其是D.lini和D.ohnishii很难区分开，只有靠杂交实验才能确定种的所属。这三个种之间存在着不同程度的生殖隔离，包括生殖前隔离和生殖后隔离。D.ogumai和D.ohnishii杂交不能产生可育的杂交F1代，而D.lini和D.ohnishii或D.lini与D.ogumai杂交产生可育F1雌性个体和不育的雄性个体。　　 与典型的果蝇求偶行为相比，lini进化枝上这三个物种的求偶行为有非常不寻常的表现。在骑乘之前，雄性从来不向雌性唱求偶歌。只有在骑乘中或者骑乘之后，甚至在交配过程中，雄性才拍动其中一只翅膀唱求偶歌。在lini进化枝中，脉冲歌是无规律的，但是这三个物种的正弦歌的频率分布与生殖隔离的表现相一致，即两个异地种正弦歌的频率是高频的(频率大约是250Hz)，而分布于两个异地种之间的D.ohnishii是低频的(频率大约是190Hz)。　　 根据对lini进化枝已有的认识，我们提出一个假设：在lini进化枝的物种交配识别系统(Specific mate recognition system, SMRS)中，正弦歌所具有的频率是至关重要的性信号之一。如果正弦歌的频率是交配成功的关键因素，那么它的遗传基础是什么？交配求偶行为是否普遍存在于montium种亚群的其它物种中?为了检验这一假设，并回答这些问题，我们设计了切翅实验和回放实验用于验证其正弦歌的功能。设计高频(D.lini)和低频(D.ohnishii)的回交体系，分析该系统中亲代和子代各个体的求偶歌频率，对正弦歌遗传控制进行初步分析。进而构建7-13天具有向雌性果蝇唱求偶歌能力的D.lini雄蝇的全长均一化的cDNA文库，分析与性成熟雄性果蝇相关的基因表达背景。还构建了高频正弦歌物种(D.lini)和低频正弦歌物种(D.ohnishii)的抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)文库，以分析唱不同频率正弦歌物种的基因表达差异。从本研究的实验中，取得如下的结果：　　 (1)切翅实验：设计了这三种果蝇九个不同配对组合，其中三个配对组合是同种配对，另外六个是异种配对。在同种配对的组合中，与正常的雄性果蝇相比，切翅雄性的骑乘持续时间明显缩短、雌性表现出强烈的排斥行为(扇动双翅并用后足踢背上的雄蝇)；这种情况同样发生在D.lini和D.ogumai异种配对的组合中，换言之，D.lini和D.ogumai之间的雌雄互动与其同种的互动相同。与此相反，在D.ohnishii与D.lini或D.ohnishii与D.ogumai异种配对中，切翅雄蝇的骑乘持续时间反而比正常有翅雄蝇的长，D.ohnishii雄蝇的拍翅对于其他两种雌蝇是一种干扰，其他两种雄蝇的拍翅对于D.ohnishii雌蝇也是一种干扰。这些结果显示，雌性排斥没有翅膀的同种雄性，也排斥不产生适当正弦歌频率的有翅异种雄性。这些间接的证据证明适当频率的正弦歌能令雌性接受雄性，并且延长骑乘持续时间。　　 (2)回放实验：合成了十二首人工正弦歌，其频率范围从140赫兹(Hz)到280赫兹。分别将其回放给三个同种配对组合和六个异种配对组合的果蝇。在同种配对组合中，当向D.lini和D.ogumai回放频率为240-250赫兹的正弦歌，向D.ohnishii回放频率为160-170赫兹的正弦歌时，雄性的骑乘持续时间得到延长，这确认了D.lini和D.ogumai的雌性更喜欢高频的正弦歌，而D.ohnishii更喜欢低频的正弦歌，显示雌性更喜欢同种雄性的正弦歌频率。在异种配对组合中，对有D.lini和D.ogumai雌性的组合回放高频正弦歌时，不管配对的是哪一种的雄性，其骑乘持续时间比回放低频正弦歌时的明显延长。相应地，对有D.ohnishii雌性的组合回放低频正弦歌时，不管配对的是哪一种的雄性，骑乘持续时间比回放高频正弦歌时的明显延长。这些结果进一步的证明了正弦歌的作用，也证明了正弦歌频率会使雌性做出偏好性的响应。　　 (3)D.kikkawai进化枝的求偶行为与性隔离：D.kikkawaii,D.bocki和D.leontia这三个物种的求偶行为与D.lini进化枝的类似。这显示交配求偶行为普遍存在于kikkawai复合种组中。此外，配偶选择实验的结果表明，在对首次骑乘的观察中，配对性隔离系数(PSI)值介于0.7389与1.2901之间，性隔离指数(ⅠPSI)值介于-0.1416与0.2671之间，这反映它们选择乘骑对象是随机的。在选择交配对象观察中，性隔离指数(ⅠPSI)值介于0.9471与0.955之间，同种交配的配对性隔离系数(PSI)值介于1.7727与2.2941之间，异种交配的配对性隔离系数(PSI)值为0。这说明在D.kikkawai进化枝中，各物种选择交配的对象不是随机的，选择同种配偶占主导，说明这三种间已经产生了明显的性隔离。另外，在西双版纳勐伦生态观测站野外观察求偶行为的结果表明，在同一香蕉诱饵上观察到5种求偶行为模式，包括预交配求偶行为和交配求偶行为，显示极高的求偶行为多样性。　　 (4)回交体系的遗传控制分析：由高频的D.lini和低频的D.ohnishii杂交形成回交体系，对其亲代和子代的求偶歌录音和分析结果显示，基于温度在23.64℃的回归分析，70个高频物种亲代个体的平均频率是230赫兹，27个低频物种亲代个体的平均频率是167.2赫兹。亲代的频率趋势与之前的研究结果一致，并且再一次确认D.lini的雄性产生的是高频的正弦歌，D.ohnishii的雄性产生的是低频的正弦歌。高频物种为母本与低频物种为父本的杂交组合(H×L)生成的14个杂交F1代个体的平均正弦歌频率是196.8赫兹。然而，低频物种为母本与高频物种为父本的杂交组合(L×H)生成的15个杂交F1代个体的平均正弦歌频率是176.4赫兹。这揭示了影响正弦歌频率的一个潜在的母体效应。对于回交后代，以杂交F1代(H×L)为母本，低频物种作为父本，所生成的72个回交个体[(H×L)×L]的平均正弦歌频率是183.2赫兹；以反交F1代(L×H)为母本与高频物种作为父本生成的192个回交个体[(L×H)×H]的平均正弦歌频率是205.1赫兹。显示除了母体效应之外，其他遗传因素存在着一定程度的影响。用约束性最大似然法(Restricted Maximum Likelihood，REML)对回交体系的各种遗传参数进行估计。结果表明对正弦歌的频率起主要作用的是常染色体上的基因，而母体效应也有明显的作用。　　 (5)全长均一化的cDNA文库：用7-13天具有对雌蝇唱歌能力的D.lini雄性成虫构建全长均一化的cDNA文库，获得了3766条序列。在拼接聚类后，有1818条非冗余序列(unigenes)，其中有1211条单一序列(singletons)和607条邻接片段序列(contigs)。从该文库中，鉴定了某些与果蝇求偶行为和生殖行为相关的基因，如合成雌性信息素中重要基因elongasef在D.lini的性成熟的雄蝇表达文库中出现，这对解释D.lini进化枝中的雄雄求偶(male-male courtship)现象意味深长；另外，与果蝇雄性行为有关的蛋白质takeout precursor，tyrosine hydroxylase和40s ribosomal protein s12的基因，与生殖行为有关的acp26ab,acp53ea和peb也出现在该文库中。具有对雌蝇唱歌能力的D.lini雄蝇的cDNA文库，可在分子水平上为该物种的求偶和生殖行为提供遗传调控的背景，并揭示D.lini求偶歌性状遗传基础的研究提供一系列候选基因。　　 (6)抑制消减杂交cDNA文库：用PCR选择cDNA消减的方法分别构建具有对雌蝇唱歌能力的D.lini和D.ohnishii雄蝇的抑制消减杂交cDNA文库。从两个抑制消减杂交文库中总共获得了485条cDNA序列。在D.lini抑制消减杂交文库中有243条序列，其中有112 singletons和42 contigs。在D.ohnishii抑制消减杂交文库中有242条序列，其中有142 singletons和30 contigs。在比较这两种具有不同正弦歌频率物种的基因表达差异中，发现某些与运动行为、飞行行为和神经肌肉触突传递相关的基因上的差异，如cryptocephal(ATF4)基因，编码cystatin-like protein的基因与运动行为相关；编码Calponin homology domain的基因与飞行行为有关；编码calcium ATPase的基因影响神经肌肉触突传递。对这些文库的进一步分析将为揭示D.lini进化枝中正弦歌的遗传学基础提供进一步研究的候选基因。　　 综上所述，本论文提供了清晰的实验证据，证明了D.lini进化枝的正弦歌在求偶过程中的作用以及雌性对正弦歌频率的偏好性。这是正弦歌频率影响果蝇雌性偏好的首次报道，这将促使montium种亚群交配求偶行为研究更为深入地展开，并导出这样的假设：正弦歌在交配求偶物种中起关键作用。对该假设的检验，在果蝇进化遗传学研究上具有重要的意义。此外，回交体系的遗传控制分析结果清楚地显示，林氏果蝇的求偶歌是由遗传控制的。全长均一化cDNA文库和抑制消减杂交文库的背录将为进一步研究正弦歌、交配求偶行为的遗传调控奠定坚实的基础，有助于更好地理解montium种亚群中求偶行为的进化。