目的:脑缺血/再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)是脑创伤、围术期脑卒中和心肺复苏后脑复苏等疾病或医疗事件的共同病理生理过程。脑细胞对缺血/缺氧的耐受性差,临床上患者常因脑IRI而出现不可逆性的中枢神经功能障碍,甚至发展至死亡。因此围术期脑IRI的防治一直是麻醉医生研究的重点和难点。近年来研究报道七氟醚、异氟醚、地氟醚等吸入麻醉剂预处理或后处理在离体脑细胞、脑组织切片和小鼠不完全性脑缺血缺氧损伤模型等不同水平均呈现出一定程度的脑保护作用,其机制可能与促进脑缺血周围神经元的功能恢复有关,但在临床上吸入麻醉剂的脑保护作用尚未得到证实。由于兔、犬及灵长类等大动物的脑部结构、神经分布和血管走形比小鼠和大鼠更复杂,且与人脑接近。因此在兔、犬等大动物的研究结果对于临床而言更有价值。本研究力求在兔建立脑栓塞模型的基础上验证异氟醚后处理(isoflurane postconditioning,IPC)对脑IRI的神经保护作用,为开发脑保护措施提供新的途径。方法:1、干燥血栓微粒的制备:兔颈动脉取血10ml,自凝、烘干后用碾钵碾成粉末状,先用100目滤网过滤得到≤240um2大小的血栓,将得到的血栓再用150目滤网过滤掉<100um2大小的血栓,最后得到100-240um2的血栓颗粒。将血栓颗粒称重、分装、环氧乙烷消毒待用。2、脑栓塞模型:新西兰大白兔,随机分配到不同栓子剂量组(2.5mg,5mg,7.5mg,10mg,12.5mg,15mg,17.5mg)和对照组,麻醉状态下分离右侧颈总动脉(common carotid artery,CCA),结扎颈外动脉(external carotid artery,ECA),沿CCA向颈内动脉(internal carotid artery,ICA)置管,固定导管,封闭切口。麻醉结束后3h,在清醒状态下,栓塞组经ICA导管注入血栓微粒,对照组注入等量生理盐水。分别在栓塞前及栓塞后5min、2h、72h行神经功能评分,在栓塞前和栓塞后72h采集静脉血检测脑损伤因子S100B,72h后处死动物取脑组织行病理学检查。3、异氟醚后处理:(1)剂量相关性研究:新西兰大白兔随机分配到不同血栓剂量的栓塞组(2.5mg,5mg,7.5mg,10mg,12.5mg,15mg)和ipc组(5mg,7.5mg,10mg,12.5mg,15mg,17.5mg)。注射栓子后5min内即开始实验,栓塞组兔吸纯氧处理1h,ipc组兔吸入1.2mac(minimumalveolarconcentration,mac)异氟醚处理1h,分别在栓塞前、栓塞后5min、2h、72h四个时间点对动物行神经功能评分,在栓塞前和栓塞后72h取静脉血检测脑损伤因子s100b,栓塞后72h处死兔子取脑组织行氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,ttc)染色,比较脑梗死体积。(2)最佳栓塞剂量对比研究:在所有栓塞剂量中选取栓塞成功率高且梗死部位稳定的5mg栓塞剂量用于异氟醚后处理脑保护作用的对比研究。新西兰大白兔随机分配到栓塞组和ipc组。注射栓子后5min内开始实验,栓塞组纯氧处理1h,ipc组1.2mac异氟醚后处理1h,分别在栓塞前和栓塞后5min、2h、72h行神经功能评分,在栓塞前和栓塞后72h取静脉血检测脑损伤因子s100b和神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,nse),栓塞后72h处死兔子取脑组织行病理学检查。结果:1、兔脑栓塞模型结果:(1)干燥血栓微粒大小均一(100~240um2),生理盐水稀释后分布均匀、不易成团、不易自溶;(2)兔脑栓塞成功率90.5%、栓塞部位较稳定:其中2.5、5、7.5mg栓塞组80%动物梗死灶分布在右侧(栓塞侧)大脑皮质;10、12.5、15mg栓塞组动物大脑双侧均出现梗死灶;随着栓子量增多,脑梗死部位从栓塞侧扩展到对侧;栓子量低于7.5mg时主要是以单侧局灶性脑梗死为主,高于7.5mg时以双侧弥漫性脑梗死为主;通过注射不同剂量的栓子建立不同梗死程度的脑栓塞模型。(3)各栓子剂量组死亡率、神经功能评分以及脑梗死体积与栓子量成正相关,尤其是栓子量在5-12.5mg之间时相关性最显著(相关系数r>0.80);栓子剂量达17.5mg时,兔子全部发生死亡。(4)2.5mg、5mg、7.5mg三个栓子剂量组,栓塞后72h的神经功能评分较栓塞后2h评分降低,表明随时间延长脑功能损伤有一定程度恢复;当栓子剂量大于7.5mg,10mg、12.5mg、15mg三个栓子剂量组栓塞后72h的神经功能评分较栓塞后2h的评分明显升高,表明脑功能损伤随时间延长逐渐加重。2、ipc对兔脑栓塞结局的影响:(1)在剂量相关性研究中,ipc组导致半数动物死亡的栓子量较栓塞组增高(11.3±2.1mgvs8.4±1.7mg,p<0.05)且ipc组动物神经功能评分达到最大值一半时的栓子量也较栓塞组增高(8.3±1.9mg vs 5.8±0.6 mg,P<0.001),两者均说明IPC使兔子能耐受的栓子剂量增大,抗脑缺血损伤能力增强;且IPC组不同栓子剂量脑梗死体积较栓塞组有下降趋势(P=0.2827),提示IPC对兔脑缺血损伤具有一定的神经保护作用。(2)在5mg栓子剂量的对比研究中,IPC组较栓塞组脑梗死体积比(%)明显减少(0.04±0.05 vs 0.09±0.06,P<0.05),神经功能评分显著降低[F(1,22)=4.452,P=0.046],血浆中脑损伤因子S100B浓度(ug/ml)下降(994.00±148.95 vs 1453.47±323.61,P=0.001),结果提示IPC对兔脑IRI有明显的保护作用。结论:1、本研究首次采用干燥血栓微粒成功建立兔局灶性脑栓塞模型,成功率高、模型稳定且重复性强;在5-12.5mg的栓子剂量范围内,脑梗死程度与栓子剂量成正相关性;栓子剂量低于7.5 mg时形成单侧局灶性的脑梗死,神经功能损伤部分恢复,而高于7.5mg时可形成双侧弥漫性脑梗死,且神经功能损伤随时间逐渐加重。这为脑栓塞的预防和治疗研究提供了不同类型的临床前研究模型。2、IPC使兔能耐受脑梗塞损伤的栓子量显著增加,增强了大脑抗缺血损伤的能力;IPC可明显减轻兔脑栓塞后的脑组织损伤,改善神经功能障碍。初步证实了IPC对兔脑IRI具有一定的神经保护作用,为研究临床围术期吸入麻醉剂脑保护作用打下了理论基础。