红细胞膜包裹黑磷量子点的制备及其在生物分析方面的研究

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黑磷量子点(BPQDs)作为一种新形式的黑磷纳米材料,具有光吸收范围宽、光热转换效率高、单线态氧产率高等优异的物理化学性质,在生物传感、药物传递、癌症治疗等生物医学领域有广阔的应用前景。在水和氧化应激的条件下,BPQDs发生降解产生磷酸盐阴离子,该磷酸盐阴离子既是生物体内的反应底物也是代谢产物。但是胞浆中磷酸盐阴离子急性升高可能会破坏细胞微环境的平衡,抑制细胞增殖甚至引发细胞死亡。此外,由于肿瘤细胞内较强的氧化应激和加速的能量代谢,BPQDs在肿瘤细胞中具有不同于正常细胞的降解行为,这使它有可能成为一种选择性杀死肿瘤细胞的生物活性纳米材料。目前,BPQDs在生物医学应用中仍面临着生物稳定性差、血液循环时间短和免疫排斥性强等问题。因此,提高BPQDs在生物体系的稳定性,延长其体内循环时间,增加BPQDs在肿瘤部位的富集程度是至关重要的。纳米载体具有生物安全性强、药物运载率高等特点,利用纳米载体对BPQDs进行封装是提高其稳定性最有效的方法,其中天然红细胞膜载体具有易于提取及纯化、体内循环时间长和免疫排斥性低等特点。这些独特的性质对改善BPQDs在生物体系的稳定性有很大的帮助,并有望成为BPQDs最佳的纳米载体。为了深入研究BPQDs在肿瘤细胞内的生物学行为,在本论文中我们设计了红细胞膜包裹黑磷量子点(BPQDs@RBCM)的纳米体系。一方面研究了BPQDs@RBCM的降解性、稳定性等理化性质;另一方面基于这些性质进一步分析了BPQDs@RBCM引发肿瘤细胞死亡的生物学行为。具体研究情况如下:(1)为了延长BPQDs在体内的循环时间,我们利用RBCM包裹BPQDs构建了BPQDs@RBCM复合纳米材料,并进行了稳定性和降解性分析。首先,我们合成了2-3 nm的超小BPQDs,再将RBCM与BPQDs混合进行挤压实现RBCM对BPQDs的包裹。BPQDs@RBCM的形貌、粒径和表面电荷(Zeta)等表征数据证明我们成功合成了具有球型外貌、尺寸为40-50 nm、Zeta电位约为-12 m A的BPQDs@RBCM。其次,凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示出BPQDs@RBCM表面膜蛋白基本无损失,紫外吸收检测也验证了BPQDs@RBCM的稳定性高于裸露的BPQDs,这对维持BPQDs在体内长时间稳定循环起到了重要作用。最后,在不同溶液条件模拟的正常生理环境和肿瘤微环境中,BPQDs@RBCM均发生了降解。而且在模拟的肿瘤微环境中,BPQDs@RBCM的降解速率要高于正常生理环境,这说明BPQDs@RBCM的稳定性得到了提高的同时还保留了降解性,并且BPQDs@RBCM的降解还具有环境选择性。综合上述研究的结果,BPQDs@RBCM有望作为生物活性纳米材料而用于肿瘤的特异性治疗。(2)为了深入分析BPQDs@RBCM在肿瘤细胞内的生物学行为及其本身的肿瘤治疗潜力,我们对BPQDs@RBCM在细胞水平的生物学毒性机理进行了探究。我们以小鼠成骨细胞(MC3T3)和口腔鳞状癌细胞(SCC7)作为研究对象,探究了BPQDs@RBCM在不同细胞内的降解行为以及对不同细胞产生的毒性作用。拉曼散射表征的结果发现,BPQDs@RBCM在SCC7细胞内的降解速率大于MC3T3细胞,且对SCC7细胞具有更大的毒性作用。为了探究BPQDs@RBCM对肿瘤细胞的毒性机制,我们通过电镜观察了BPQDs@RBCM对SCC7细胞内活性氧(ROS)含量和细胞器结构的影响,并利用蛋白免疫印迹技术探究了细胞凋亡通路相关蛋白的表达情况。结果发现,BPQDs@RBCM可以通过ROS途径引发胞内自噬泡增加,促进自噬水平提高,引发细胞凋亡。通过BPQDs@RBCM对SCC7细胞的生物学毒性机制分析,这为未来BPQDs体内抗肿瘤性能研究提供了一定的借鉴意义。
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