[目的](1)研究骨髓基质细胞系HS-5细胞条件培养基(conditioned medium,CM)对一代布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s Tyrosine Kinase,BTK)抑制剂伊布替尼(ibrutinib)和二代BTK抑制剂阿卡替尼(acalabrutinib)抗套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL)作用的影响,并借助高通量转录组测序技术揭示其分子机制。(2)评价盐霉素(salinomycin,Sal)是否可以增强二代BTK抑制剂阿卡替尼的抗MCL作用,并揭示对其潜在的分子机制。[方法](1)本研究以常规培养基培养且未经条件培养基及药物处理的套细胞淋巴瘤细胞系Mino细胞作为对照组,实验组包括条件培养基组、伊布替尼/阿卡替尼组、伊布替尼/阿卡替尼+条件培养基组。通过培养HS-5细胞获得无血清的条件培养基,利用Alamar Blue法检测条件培养基对Mino细胞增殖活性的影响,以及伊布替尼或阿卡替尼对HS-5条件培养基增强Mino细胞增殖活性的作用。借助高通量转录组测序,比较各组间的差异表达mRNA,并对其进行生物信息学分析,分析方法主要包括差异表达模式聚类分析、差异基因京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分类分析、差异基因Pathway富集因子分析等,从而揭示差异基因可能存在的功能以及参与的信号通路。(2)通过观察盐霉素与阿卡替尼联合用药对Mino细胞增殖活性、凋亡和细胞周期的影响,并对其机制进行初步探讨。实验设对照组、盐霉素组、阿卡替尼组以及阿卡替尼与盐霉素联合用药组,采用Alamar Blue法检测细胞增殖活性;采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期;采用Western blot检测各组B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、细胞周期蛋白 D1(cell cycle protein D1,cyclin D1)、裂解的聚 ADP 核糖聚合酶(cleaved poly ADP-ribose polymerase,cleaved-PARP)、cleaved-caspase3蛋白表达水平。[结果]本文采用上述研究方法开展实验并得到以下研究结果:(1)HS-5条件培养基与常规培养基相比增强Mino细胞的增殖活性。伊布替尼/阿卡替尼均能抑制Mino细胞的增殖活性,且对此有时间依耐性。HS-5条件培养基能够显著削弱伊布替尼/阿卡替尼对Mino细胞增殖活性的抑制作用。经高通量转录组测序并结合各类分析方法,表明条件培养基支持Mino细胞生长的差异表达基因主要富集的信号通路包括B细胞信号转导、细胞凋亡、细胞粘附/迁移以及免疫系统中的细胞因子信号,在这些信号通路中部分基因能够被伊布替尼所调控,但仍有部分基因不能被伊布替尼所调控。(2)Alamar Blue实验表明,盐霉素及阿卡替尼单用或两药联合均能显著抑制Mino的存活和增殖,且两药联合对抑制Mino细胞的增殖活性具有协同作用。流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期发现盐霉素增强了阿卡替尼诱导的Mino细胞凋亡和减少了 S、G2/M期细胞。Western blot检测发现盐霉素与阿卡替尼联合较阿卡替尼单独作用于Mino的Bcl-2、cyclinD1蛋白表达水平进一步降低,cleaved-PARP、cleaved-caspase3 蛋白表达水平进一步升高。[结论](1)HS-5条件培养基不仅增强了 Mino细胞的增殖活性,还削弱了伊布替尼及阿卡替尼对Mino细胞的细胞毒性作用,证实基质细胞在MCL发生发展及其对BTK抑制剂耐药过程中发挥重要作用。借助高通量测序结果发现条件培养基支持Mino细胞生长的差异表达基因主要富集的信号通路包括B细胞信号转导、细胞凋亡、细胞粘附/迁移以及免疫系统中的细胞因子信号,在这些信号通路中部分基因能够被伊布替尼所调控,但仍有部分基因不能被伊布替尼所调控,这为发现MCL新的治疗靶点、寻找新的靶标与BTK抑制剂发挥协同作用进而可能克服其耐药提供了思路。(2)盐霉素与阿卡替尼联合用药具有协同抑制Mino细胞存活、增强细胞凋亡以及细胞周期阻滞的作用。