软骨缺损的修复是临床一大难题,由于自体软骨移植来源有限,组织工程化软骨移植将是解决损伤软骨修复的重要途径,然而,组织工程化软骨具有免疫原性。本课题拟通过转染吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)基因以达到改变软骨细胞移植后局部T细胞免疫应答负调的目的,诱导移植受体的T细胞对同种异体组织工程化软骨移植物的免疫耐受,为发展转基因方法预防临床同种异体移植后自身免疫排斥的技术奠定基础,实现组织工程化的种子细胞能用于不同免疫遗传背景的患者,克服MHC(major histocompatibility complex,主要组织相容性复合物)的多态性和多基因性所形成的同种异体间的免疫屏障,达到组织工程化种子细胞的“通用化”,开辟了从移植物局部解决免疫排斥的新途径。主要内容及结果如下:(一)小鼠软骨细胞的分离和培养1.C57小鼠关节软骨的获取:体外经0.2%Ⅱ型胶原酶37℃消化3～4 h后离心,收集可以获取供实验用的大量软骨细胞,台盼蓝染色消化法获取的软骨细胞活力在95%以上。2.原代培养的软骨细胞,MTT法检测软骨细胞生长曲线,发现软骨细胞贴壁后于第2～5 d进入指数生长期,7 d左右可以铺满瓶底,但是随着细胞传代次数的增加,细胞形成一代的时间明显延长。3.软骨细胞分泌的细胞外基质,对甲苯胺蓝染色呈明显蓝色异染反应,本实验获取的软骨细胞经甲苯胺蓝染色后,发现细胞纯度在85%以上,但是随着传代次数增多软骨细胞分泌细胞外基质的能力下降,因此,选择第2、3代软骨细胞是用于实验的最佳时期。(二)软骨细胞pEGFP-N1-IDO质粒转染及基因表达1.在最优化的脂质体和质粒比例下(2:1),质粒pEGFP-N1-IDO被脂质体转染至原代培养的软骨细胞,转染后的软骨细胞仍能贴壁生长。2.荧光显微镜和激光共聚焦显微镜对转染后的软骨细胞中EGFP表达的监测表明,绿色荧光均匀地分布于整个细胞内,于转染后12 h开始并在48 h时有较强表达。EGFP在胞浆和胞核中均有表达,但胞浆中表达明显高于胞核表达。3.于转染后不同时间点收集软骨细胞,多聚甲醛固定后,流式细胞术检测软骨细胞中EGFP的表达,转染后随着时间的延长,转染效率呈先上升,后下降的趋势。于转染后24 h达到最高峰,48 h后转染效率可高达36%。4.软骨细胞基因转染48 h后,RT-PCR在RNA水平可检测到mIDO表达,与β-actin的光密度值相比,软骨细胞中基因的相对表达量稳定。(三) mIDO转染后软骨细胞体外对T淋巴细胞增殖的影响1.利用高压液相色谱(HPLC)分析mIDO转染软骨细胞培养液中色氨酸的含量,24 h后单纯软骨细胞组色氨酸含量为4.93～5.71 mg/L,平均为5.3±0.39 mg/L,而基因转染软骨细胞组未检测到色氨酸。在细胞培养液中色氨酸的降解,同时也伴随着犬尿氨酸代谢产物的增加,对细胞上清液中色氨酸消除动力学研究表明,转基因软骨细胞上清液中色氨酸的降解明显快于单纯软骨细胞组。2.转基因软骨细胞体外混合淋巴细胞反应,以2×105个经3 000 radγ射线照射的脾淋巴细胞作为抗原递呈细胞和3×105个淋巴结淋巴细胞作为免疫应答细胞,于混合反应后第5 d、6 d、7 d、8 d通过MTT法检测各组淋巴细胞增殖情况。结果显示,较单纯淋巴细胞脾细胞组,转基因和未转基因组淋巴细胞均出现了增殖(P<0.02),且转IDO基因组淋巴细胞增殖较未转基因组明显减慢(P<0.05)。3.混合淋巴细胞反应中以CFSE标记免疫应答细胞,共同培养96 h后经流式细胞术检测应答T细胞的增殖,转基因组和未转基因组应答细胞均出现了增殖(P<0.01),共形成9代细胞。IDO基因转染组96 h后总体增殖指数为1.122±0.017,单纯淋巴细胞阴性对照组为1.026±0.016,阳性单纯软骨细胞组为1.201±0.026,较阳性对照组,IDO基因组同种异体T淋巴细胞增殖得到明显抑制。结论:消化法可获取供实验用的大量原代培养的软骨细胞,且第2、3代软骨细胞是用于实验的最佳时期;脂质体有望成为原代培养软骨细胞良好的基因转导载体,mIDO被导入原代培养的软骨细胞后,对EGFP监测表明,IDO在细胞中得到了稳定表达,且主要表达于胞浆;转基因细胞体外培养中明显降解培养液中色氨酸浓度,为IDO通过降解局部微环境中色氨酸浓度而抑制同种异体T细胞增殖提供科学依据;体外混合淋巴细胞反应中,表达mIDO转染软骨细胞明显抑制同种异体T细胞增殖,为基因转染后软骨细胞通过降解局部微环境中色氨酸的浓度抑制T细胞的增殖从而延长移植物的存活时间提供了思路。