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睾丸间质细胞分布在睾丸曲细精管之间,可以合成和分泌雄激素,从而促进雄性动物的精子发生和生殖器官发育,间质细胞的凋亡水平与睾丸的功能密切相关。研究表明,生物钟系统在维持哺乳动物繁殖性能方面具有重要的作用。BMAL1是一种核心的生物钟基因,有研究显示,其能参与多种细胞的凋亡,BMAL1对睾丸间质细胞凋亡和睾酮分泌的影响尚未见报道。本文旨在研究BMAL1基因对小鼠睾丸间质细胞凋亡、睾酮分泌及PI3K(Phosphatidylinositol 3-kinase,磷脂酰肌醇3激酶)/AKT(Protein kinase B,蛋白激酶B)信号通路的影响。使用小鼠睾丸间质细胞系TM3作为研究对象,使用小干扰RNA(si RNA)抑制时钟基因BMAL1的表达,流式细胞术、实时荧光定量PCR(q RT-PCR)、和Western Blot用于检测敲减BMAL1表达对TM3细胞凋亡的影响;使用ELISA检测睾酮分泌,q RT-PCR和Western Blot检测睾酮合成相关基因:类固醇急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein,STAR)、胆固醇侧链裂解酶(Cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1,CYP11A1)和3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)的m RNA及蛋白表达水平;Western Blot用于检测PI3K/AKT信号通路的磷酸化水平。研究结果如下:1、选用三条si RNA转染24或48 h,分别检测基因及蛋白表达,q RT-PCR检测并筛选最佳干扰效率,结果显示混合si RNA干扰效率最佳为50%-60%;流式细胞术结果显示,敲减BMAL1基因显著上调小鼠睾丸间质细胞的凋亡水平(P<0.05);q RT-PCR和Western Blot结果显示,敲减BMAL1基因可显著上调促凋亡基因BAX的m RNA和蛋白表达量(P<0.05)、下调抑凋亡基因BCL-2的m RNA和蛋白表达量(P<0.05)。2、混合si RNA转染24或48 h,ELISA、q RT-PCR和Western Blot检测敲减BMAL1的表达后,对睾酮分泌及合成关键基因STAR、CYP11A1和3β-HSD的m RNA和蛋白表达水平的影响。结果显示,与NC(Negative Control)组相比,si RNA干扰组睾酮分泌及合成关键基因STAR、CYP11A1和3β-HSD mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05)。3、采用Western Blot方法检测敲减小鼠睾丸间质细胞BMAL1基因表达后,PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT蛋白的表达水平,结果发现,BMAL1表达降低导致PI3K和AKT的蛋白磷酸化水平显著下降(P<0.05)。本研究结果表明,敲减BMAL1可能通过抑制PI3K/AKT信号传导途径的活性,导致小鼠睾丸间质细胞凋亡水平增加和睾酮分泌及关键合成基因表达的降低。