第一章 AMPK激动剂AICAR和二甲双胍调控INS-1E胰岛β细胞凋亡及其机制研究　　研究目的:　　AMPK作为能量代谢的感受器，在外周胰岛素敏感组织如肝脏、骨骼肌和脂肪中对糖脂代谢调控起重要作用。然而，它在胰岛β细胞中的作用，尤其是对β细胞凋亡的影响仍存在争议。本文拟应用两个常用AMPK激动剂AICAR和二甲双胍研究其对大鼠胰岛素瘤INS-1E细胞凋亡的影响及其作用机制。　　内容及方法:　　在INS-1E细胞中，利用饱和脂肪酸palmitate诱导细胞凋亡，以细胞内cleavedcaspase3蛋白含量及caspase3/7活性作为凋亡水平的指标，观察AICAR和二甲双胍对凋亡的影响。在此条件下，研究化合物对脂质代谢（脂肪酸氧化、甘油三酯和胆固醇累积）和Akt、JNK及p38 MAPK磷酸化(p-Akt，p-JNK和p-p38MAPK)水平的影响，并应用AMPK抑制剂compound C研究化合物对凋亡的调控及相关作用机制与AMPK信号通路的关系。同时，本研究还观察了正常培养条件下AICAR和二甲双胍对细胞内p-JNK水平及cleaved caspase3蛋白含量的影响，并应用JNK抑制剂JNK-IN-8及compound C研究JNK及AMPK信号通路在此过程中的作用。　　结果:　　AICAR和二甲双胍均可不同程度地逆转palmitate长期处理INS-1E细胞后引起的cleaved caspase3蛋白含量及caspase3/7活性的升高，提示其对palmitate诱导的细胞凋亡具有逆转作用;此时，AICAR和二甲双胍均可激活AMPK信号通路，且应用compound C抑制AMPK信号通路后，两者降低cleaved caspase3蛋白含量的作用消失。Palmitate长期处理后，细胞内甘油三酯累积增加，AICAR共处理后可显著降低甘油三酯含量，且此作用可被compound C所阻断;而二甲双胍则对甘油三酯含量无影响。此外，Palmitate长期处理后，细胞内p-Akt降低、p-JNK升高而p-p38 MAPK不变;AICAR共处理后，可增加p-Akt和p-JNK而降低p-p38 MAPK;而二甲双胍共处理后，对p-Akt无影响，但可同时降低p-JNK和p-p38 MAPK。应用compound C后，AICAR和二甲双胍对上述激酶的调控作用均被不同程度地阻断。　　另一方面，在正常培养条件下，AICAR增加cleaved caspase3蛋白水平，提示其具有促凋亡作用。同时，AICAR还可增加p-JNK并激活AMPK信号通路，JNK-IN-8和compound C可不同程度地阻断AICAR的促凋亡作用，且compoundC可阻断AICAR对JNK的激活作用。在相同培养条件下，二甲双胍显著降低p-JNK水平，且对cleaved caspase3蛋白水平无升高作用，提示其不具有促凋亡作用。　　结论:　　AICAR和二甲双胍均可抑制palmitate诱导的INS-1E细胞凋亡，该作用依赖于化合物对AMPK信号通路的激活。AICAR可能通过降低palmitate诱导的甘油三酯累积、激活Akt和抑制p38 MAPK来逆转凋亡;而二甲双胍则可能通过抑制JNK和p38 MAPK来保护细胞。这些作用机制均依赖于化合物对AMPK的激活。然而，在正常培养条件下，AICAR可通过激活AMPK-JNK途径而引起细胞凋亡;但二甲双胍对凋亡无影响，这可能与其对JNK的抑制作用有关。本研究揭示了在不同的培养条件下，AICAR和二甲双胍对INS-1E细胞凋亡的调控不同，这可能是由不同下游机制所介导的。本论文从一个较为新颖的角度解释了“AMPK调控β细胞凋亡”这一议题中的争议点，也为后续的研究提供了新思路。　　第二章天然产物arctigenin调控胰岛β细胞凋亡及其作用机制研究　　研究目的:　　前期研究表明，天然产物arctigenin可显著改善骨骼肌和肝脏糖脂代谢，并在ob/ob小鼠中发挥抗糖尿病的作用。然而，arctigenin对糖尿病相关的另一个靶组织——胰岛β细胞的调控仍未知。在ob/ob小鼠中，arctigenin并无直接的促胰岛素分泌作用，而长期给药后可显著促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌，提示arctigenin可能改善了胰岛功能。故本论文将集中研究arctigenin对胰岛β细胞功能的调控作用，并对相关机制进行探索，为更完整地阐述arctigenin的抗糖尿病活性提供进一步的实验依据。　　内容及方法:　　建立高糖或高脂(palmitate)诱导大鼠胰岛素瘤INS-1E细胞凋亡模型，在分子、蛋白和形态学水平上研究arctigenin对高糖或高脂诱导的INS-1E细胞凋亡的影响，并开展了相关的作用机制探索，包括脂质代谢（甘油三酯含量、脂肪酸氧化及脂合成关键酶的基因表达水平）、内质网应激（Xbp-1基因的剪切及Grp78和Grp94的基因表达水平）及MAPK信号通路（JNK和p38 MAPK磷酸化水平）等。同时，采用2型糖尿病Zucker diabetic fatty(ZDF)大鼠模型，观察arctigenin长期给药后对ZDF大鼠胰岛功能的保护作用，并观察arctigenin对ZDF大鼠血清胰岛素水平、血糖、血脂、摄食量和体重等糖尿病相关指标的影响。　　结果:　　INS-1E细胞经高糖或高脂处理后，细胞凋亡率显著升高，arctigenin共处理可剂量依赖性地逆转高糖或高脂诱导的细胞凋亡。对arctigenin抗高糖诱导的INS-1E细胞凋亡作用机制的研究发现，arctigenin可降低高糖诱导的细胞内甘油三酯累积，逆转高糖对脂肪酸氧化的抑制作用，并抑制高糖诱导的脂肪酸从头合成过程中关键酶Fasn和Acc1基因表达水平的升高;arctigenin还可抑制高糖诱导的JNK磷酸化水平的升高，并对p38 MAPK磷酸化水平有降低的趋势。对arctigenin抗高脂诱导的INS-1E细胞凋亡作用机制的研究发现，arctigenin可降低高脂诱导的细胞内甘油三酯累积，但不能逆转高脂对脂肪酸氧化的抑制作用;arctigenin可抑制高脂诱导的Xbp-1基因的剪切及Grp78和Grp94基因表达水平的升高;arctigenin还可抑制高脂诱导的JNK磷酸化水平的升高，并显著降低p38 MAPK磷酸化水平。ZDF大鼠实验结果表明，arctigenin长期给药后可明显延缓ZDF大鼠血清胰岛素水平的下降及随机和空腹血糖的升高，降低糖化血红蛋白水平;增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌，改善糖耐量和胰岛形态并增强胰腺内胰岛素染色水平;降低血清甘油三酯和总胆固醇水平;arctigenin长期给药对ZDF大鼠摄食有一定的抑制作用，但对体重无明显影响。　　结论:　　本研究首次证实天然产物arctigenin可逆转高糖或高脂诱导的INS-1E细胞凋亡，降低细胞内甘油三酯累积、缓解内质网应激及抑制MAPK信号通路可能是化合物抗凋亡的作用机制。Arctigenin长期给药后可改善ZDF大鼠胰岛功能，延缓其糖尿病的发病进程。本研究在体外和体内较为系统地研究了arctigenin对胰岛β细胞的保护作用，为基于该化合物的抗糖尿病候选新药研发提供了实验依据。