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第一部分外源性硫化氢和多奈哌齐对Aβ25-35致PC12细胞损伤的保护作用目的:观察外源性硫化氢(H2S)及多奈哌齐(donepezil)对β淀粉样蛋白25-35(β-amyloid peptide25-35,Aβ25-35)致大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞损伤的细胞生存保护作用。方法:以体外培养的PC12细胞为研究对象,用硫氢化钠(NaHS)作为外源性H2S供体。实验设空白对照组、Aβ25-35组、NaHS组、NaHS+Aβ25-35组、多奈哌齐组、多奈哌齐+Aβ25-35组共6组。NaHS的浓度为10、25、50、100、200、500、1000μmol.L,而Aβ25-35和多奈哌齐的浓度都为20μmol/L.按分组浓度分别处理PC12细胞24h后,用甲氮甲唑蓝法(MTT)检测细胞成活率。结果:①Aβ25-35能显著降低PC12细胞的存活率(P<0.05);②用不同浓度NaHS预处理后,10μmol/L的NaHS本身不影响PC12细胞的存活率(P>0.05),但25μmol/L~200μmol.LNaHS能提高PC12细胞的存活率(P<0.05),也能抑制20μmol/L Aβ25-35诱导的细胞毒性,可使PC12细胞存活率明显提高(P<0.05),然而100μmol/LNaHS和200μmol/LNaHS相比,100μmol/LNaHS具有更好的保护细胞的作用(P<0.05)。但500和1000μmol/L的NaHS对PC12细胞本身具有毒性作用(P>0.05);③多奈哌齐能降低Aβ25-35引起的细胞毒性作用,提高PC12细胞存活率(P<0.05)。④20μmol/L多奈哌齐与200μmol/LNaHS比较,无明显差异,都能保护Aβ25-35所致的PC12损伤。对培养PC12细胞存活的最佳NaHS浓度是100μmol/L。结论:H2S及多奈哌齐都对Aβ25-35致PC12细胞损伤具有保护作用。第二部分外源性硫化氢和多奈哌齐对PC12细胞APP/Aβ代谢途径的影响目的:探讨外源性H2S及多奈哌齐对PC12细胞淀粉样前体蛋白/β-位淀粉样蛋白(APP/Aβ)代谢的影响。方法:以PC12细胞为研究对象,用NaHS作外源性H2S供体,实验设空白对照组、NaHS10μmol/L组、25、50、100、200μmol/L组、多奈哌齐20μmol/L组,共7组。按分组浓度分别处理PC12细胞24h后,用Western blot检测代谢过程中关键蛋白APP表达变化;ELISA检测细胞培养上清液中Aβ40、Aβ42、sAPPα、 sAPPβ的蛋白水平。结果:①不同浓度NaHS和多奈哌齐对APP蛋白表达水平无明显差异(P>0.05);②不同浓度NaHS和多奈哌齐均可降低Aβ40, Aβ42和sAPPβ蛋白表达水平,还可增高sAPPα蛋白表达水平,这种作用与H2S浓度有相关性。结论:外源性H2S和多奈哌齐可以诱导APP/Aβ代谢途径向非淀粉样途径(α途径)转变,H2S的这种作用具有浓度依赖性。第三部分外源性硫化氢和多奈哌齐对PC12细胞α分泌酶(ADAM10/ADAM17)的影响目的:观察H2S和多奈哌齐对PC12细胞α-分泌酶ADAM10和ADAM10蛋白的影响,探讨二者对APP代谢途径的转变作用是否与ADAM10和ADAM17相关。方法:以PC12细胞为研究对象,用NaHS作外源性H2S供体,实验设空白对照组、NaHS10、25、50、100和200μmol/L组、多奈哌齐20μmol/L组,共7组。按分组浓度分别处理PC12细胞24h后,用Western blot检测代谢过程中关键蛋白ADAM10和ADAM17的表达水平。结果:不同浓度NaHS和多奈哌齐组的ADAM10和ADAM17蛋白表达水平较对照组增高,且随着NaHS浓度增加,蛋白表达水平呈递增趋势(P<0.05)。100μmol/L和200μmol/LNaHS组的ADAM10及ADAM17表达水平无明显差异(P>0.05),但100μmol/LNaHS组的ADAM10及ADAM17蛋白表达水平最高(P<0.01)。结论:①外源性H2S和多奈哌齐具有上调体外培养的PC12细胞α分泌酶(ADAM10、ADAM17)蛋白表达水平;②外源性H2S和多奈哌齐使APP/Aβ代谢途径向非淀粉样途径转变,可能与α分泌酶的核心蛋白ADAM10和ADAM17蛋白表达水平增高有关。第四部分外源性硫化氢和多奈哌齐对调控APP的α代谢途径三条细胞信号通路的研究目的:观察外源性H2S及多奈哌齐对APP的α代谢途径中PI3-K、 MAPKs及JNK3条主要细胞信号通路的影响,探讨二者的细胞信号机制。方法:以体外培养的PC12细胞为研究对象,用NaHS作外源性H2S供体。①实验先设为空白对照组,P13-K抑制剂LY组(LY294002,20μmol/L),p38MAPK抑制剂SB组(SB203580,30μmol/L)、 JNK抑制剂SP组(SP600125,20μmol/L),共4组。②实验再设置为空白对照组,NaHS100μmol/L组,NaHS100μmol/L+SP组,NaHS100μmol/L+LY组,NaHS100μmol/L+SB组,多奈哌齐20μmol/L组,多奈哌齐20μmol/L+SP组,多奈哌齐20μmol/L+LY组,多奈哌齐20μmol/L+SB组,共9组。PC12细胞在加入NaHS100μmol/L或多奈哌齐μmol/L前30min,先加入SP600125、LY294002、SB203580。干预24h后,用Western blot法检测APP、ADAM10和ADAM17蛋白表达水平;ELISA检测细胞培养上清液中Aβ40、Aβ42、sAPPα和sAPβ的蛋白水平。结果:①SP组、LY组、SB组APP蛋白以及SB组ADAM10和ADAM17蛋白表达水平无明显影响(P>0.05),而SP组、LY组ADAM10和ADAM17的蛋白表达降低。②SB组Aβ40、Aβ42、sAPPβ和sAPPα蛋白表达与对照组比较无显著变化(P>0.05)。LY组、SP组Aβ40、Aβ42和sAPPβ蛋白表达显著增强,并降低sAPPα蛋白的表达,与对照组比较具有显著差异性(P<0.01)。③SP组、LY组H2S增强ADAM10蛋白表达的作用降低,H2S降低Aβ40、Aβ42和sAPPβ蛋白表达的作用减弱,与对照组比较具有显著差异(P<0.01);SB组、SP组、LY组多奈哌齐增强ADAM10、ADAM17蛋白表达的作用均降低,多奈哌齐降低Aβ40、Aβ42和sAPPβ蛋白表达的作用减弱,与对照组比较具有显著差异(P<0.01)。④SP组、LY组可抑制H2S升高sAPPα蛋白的表达,与对照组比较具有显著差异(P<0.01);SB组、SP组、LY组可抑制多奈哌齐升高sAPPα蛋白的表达,与对照组比较具有显著差异(P<0.01)。结论:①外源性H2S具有上调体外培养的PC12细胞APPα代谢途径中关键蛋白ADAM10和ADAM17,能明显提高sAPPα的表达,有效的减少Aβ40、Aβ42和sAPPβ病理产物的生成,使APP/Aβ代谢途径向非淀粉样途径(α途径)转变,其机制可能涉及P13-K或JNK信号通路。②多奈哌齐具有H2S相似的作用,其机制可能涉及PI3-K、JNK信号通路或p38MAPK通路。说明H2S与多奈哌齐在增强APP的非淀粉样代谢途径(α代谢途径)调控中具有相似的细胞信号机制。