基因免疫制备乙肝X蛋白抗体及肝细胞癌患者血清中X蛋白检测

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目的: 1.构建含有完整乙型肝炎病毒X基因序列的基因疫苗并用该疫苗免疫BALB/c小鼠制备抗乙型肝炎病毒X蛋白的抗体。 2.鉴定抗乙型肝炎病毒X蛋白的抗体的特异性并初步判断其效价后,用该抗体检测肝细胞癌患者血清中X蛋白,同时对X蛋白阳性患者血清中X基因进行检测。 方法: 1.基因疫苗的构建:用PCR法从含有HBV X基因的原核表达载体pET-25b(+)-HBV X扩增含完整X基因的重组x基因片段,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转化受体菌DH5α,酶切及测序证实。 2.基因免疫制备抗体:用质粒提取试剂盒大量制备基因疫苗。于BALB/c小鼠的大腿肌肉内注射100μg基因疫苗做初次免疫,并在第19,29,39及49天用相同剂量做加强免疫。证实免疫成功后在产生最大抗体滴度时摘眼球取血并分离保存血清。 3.抗体特异性鉴定及效价判断:每次免疫前一天和最后一次免疫后第2、4、6、8周经小鼠尾静脉取血分离血清。将原核表达载体抽提纯化后,转化表达菌株BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组x蛋白,用该蛋白鉴定血清中的抗体特异性并初步判断其效价。 4.肝细胞癌患者血清中X蛋白的检测:用基因免疫制备的抗体作为一抗、以western Blot法检测肝细胞癌患者血清中x蛋白。 5.HBx阳性患者血清中X基因的检测:用X蛋白(HBx)检测阳性患者血清中提取的DNA作为模板,以PCR法检测血清中x基因。 结果: 1.构建的基因疫苗.pcDNA3.1(+)-HBV X经用限制性核酸内切酶酶谱分析、DNA序列测定等方法证实含有完整的HBV X基因序列。 2.利用原核表达的重组X蛋白作为抗原,检测到经基因免疫后小鼠血清中的抗X蛋白抗体,该抗体特异性良好,其最大抗血清滴度为100左右。 3.利用该抗体检测肝细胞癌患者血清中的X蛋白,检出率为17.5%(7/40) 。 4.HBx检测阳性者血清中均能扩增出约470bp大小的X基因片段。 结论: 1.成功构建了含完整HBV X基因的基因疫苗pcDNA3.1(+)-HBV X。 2.用该疫苗进行基因免疫后的BALB/c小鼠血清中产生了抗X蛋白的抗体。 3.该抗体可用来检测肝细胞癌患者血清中的X蛋白,并与X基因的检测结果一致。
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