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α-苦瓜素(Alpha-momorcharin,α-MMC)是来源于苦瓜的一种单链Ⅰ型核糖体失活蛋白,具有抗病毒、抗肿瘤等多种生物学活性。但是由于α-MMC作为大分子药物难以有效跨膜进入细胞发挥抗肿瘤作用,因而限制了其药理学应用。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一类自身具有跨膜能力多肽,且可以有效携带多种生物活性物质进入细胞内以发挥其药理活性。本课题组在前期研究发现一种来源于人超氧化物歧化酶的细胞穿膜肽HBD具有高效的穿膜能力。此外,一种来源于人肝素结合表皮生长因子样生长因子的肝素结合肽(命名为HBP)也被鉴定具有穿膜作用。为了增强α-MMC的抗肿瘤作用,本课题分别将这两种穿模肽HBD和HBP与α-MMC融合表达,以提高α-MMC对肿瘤细胞的穿膜效率,进而增加对肿瘤细胞药理毒性。通过基因工程技术分别将HBD和HBP融合到α-MMC的C-末端,获得α-MMC-HBD和α-MMC-HBP重组质粒,通过原核大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)表达条件的优化、Ni-NTA柱亲和纯化,在E.coli Origami 2(DE3)中成功获得各种上清表达的α-MMC融合蛋白。DNase活性和N-糖苷酶活性检测实验证实融合了 CPP(HBD或HBP)的重组蛋白仍然保留了天然α-MMC的内在生物活性。通过激光共聚焦显微镜观察发现,FITC标记的α-MMC-HBP融合蛋白的穿膜效率明显高于没有融合CPP的单独α-MMC以及融合了 HBD的α-MMC,表明HBP的引入比HBD更好地提高了α-MMC穿透细胞膜的能力。体外的细胞存活实验证实了在测试的六种肿瘤细胞中,融合了HBP的α-MMC对肿瘤细胞毒性显著增强,且表现出浓度依赖性,特别是对95D细胞,α-MMC-HBP的IC50值与单独的α-MMC相比,降低了约180倍。流式凋亡术分析表明,HBP的引入显著增强α-MMC诱导细胞凋亡的能力,western blot实验进一步表明α-MMC-HBP通过更显著地下调酶原caspase 8、酶原caspase 9、酶原caspase 3、酶原PARP的表达水平,以及上调cleaved-PARP的表达水平和Bax/Bcl-2比例来激活死亡受体和线粒体调节细胞凋亡信号途径,进而导致细胞凋亡。线粒体膜电位实验表明α-MMC-HBP也可以降低线粒体膜电位来引起肿瘤细胞凋亡。此外,细胞划痕实验显示HBP的引入可以增强α-MMC抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移的能力。本课题首次将CPP与α-MMC进行融合表达,结果显示HBP可以增强α-MMC的穿膜能力和细胞毒性。本论文为拓展α-MMC在抗肿瘤研究中的应用提供了一种新的策略。