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我国是竹笋出口大国,年产量为320万吨以上,居世界之首。竹笋残渣是在竹笋加工过程中丢弃的剩余物,占竹笋的50～70％,若不加以合理利用,既是有效资源的极大浪费,又对环境造成了污染,影响生态平衡。因此,将竹笋残渣进行深加工,充分开发微生物资源,利用微生物发酵竹笋残渣制取植物甾醇,即是重要的环保措施,又能提高竹笋加工业的经济效益,是一个很好的研究思路。
为此,本研究以重庆方竹笋残渣为原料,通过从腐烂竹笋残渣中分离得到9种菌种,并筛选出产植物甾醇能力最强的黑曲霉。在将该黑曲霉经驯化和单因素的基础上,通过二次正交选择组合实验,得到了最佳发酵产植物甾醇工艺条件。在此基础上,通过比较分析5种不同的提取方法所得植物甾醇含量,得到最佳提取方法。主要结果如下:
1.研究了Liebermann-Burchard比色法和高效液相色谱法(HPLC)测定植物甾醇;通过优化比色法测定竹笋总甾醇:反应24min后,于波长610nm处测定吸光度效果最佳。通过建立HPLC法检测分析竹笋主要甾醇类化合物:发现在采用Ultimate XB-C18色谱柱,流动相选择甲醇:乙腈=35:65、波长选择200nm、柱温:28℃、流速1.0mL/min条件下检测效果最佳。
2.通过设计8组竹笋残渣堆积方式进行腐烂,从中选出最佳菌种源,并对其进行分类传代培养,经特异性琼脂培养基多次平板分离后,得到9种菌种,从中筛选出产植物甾醇能力最强的菌种,经鉴定该菌种为黑曲霉。
3.对分离得到的高产植物甾醇黑曲霉进行了发酵工艺优化。研究结果表明,黑曲霉经驯化3次,发酵方式为固态好养、菌种接种量4.2mL/100g.发酵时间5.3天、发酵温度33.3℃、氮源为尿素、氮源添加量4.1％的条件下获得最佳发酵效果,此时发酵样品的总甾醇含量为1168±32.4mg/100g。
4.采用索式提取法、细胞粉碎法、回流法、超声辅助法及传统溶剂浸提法对发酵前后的样品进行提取。通过测定各提取工艺所得的总甾醇含量并比较其提取率,结果表明索式提取法>超声细胞粉碎法>回流法>超声辅助法>传统溶剂浸提法,再结合实际提取过程中因考虑的能耗大小、环境问题、操作难易等因素,最终选择超声细胞粉碎法做为最佳提取工艺。
5.以发酵前的竹笋残渣为原料,总甾醇及β-谷甾醇提取率为考察指标,对超声细胞粉碎提取工艺进行优化。研究结果表明,在料液比1:31、超声功率410w、超声时间10.5 min、颗粒粒径86目的条件下获得最佳提取效果,此时总甾醇提取率为85.6％β-谷甾醇提取率为86.8％。