论文部分内容阅读
海绵状脑病是细胞型朊蛋白PrPc构象转变形成致病性朊病毒PrPsc导致的。PrPc是广泛分布于各种细胞内并参与信号转导等细胞事件的膜糖蛋白。浮舰蛋白包括Flotillin-1和-2，是分子发生相互作用和信号转导的绞架蛋白，形成了独特的没有窖样结构的脂筏，为PrPc转变成PrPsc和PrPc发挥生理功能提供了场所。本研究旨在通过构建缺失突变体和采用酵母双杂交法确定PrPc与flotillins的相互作用及其分子区域，为设计阻断PrPc转变成PrPsc的靶药物提供理论依据。利用从牛脑组织中扩增出PrPc、Flotillin-1和-2的ORF，PCR扩增出成熟朊蛋白PrP25-241、朊病毒核心片段PrP102-241编码基因，重组到捕获载体pGADT7上。扩增出Flotillin-1八个缺失突变体（分别为36-428aa，1-331aa，1-161aa，151-428aa，1-134aa，36-161aa，1-151aa和331-428aa）编码基因，连同Flotillin-1和-2的ORF重组到诱饵载体pGBKT7上，测序验证。自激活和毒性分析：采用PEG/LiAc法分别将上述捕获和诱饵载体转入AH109酵母菌中，转化液涂在SD/-Trp/X-α-Gal、 SD/-Leu/X-α-Gal、 SD/-His/-Trp/X-α-Gal、 SD/-His/-Leu/X-α-Gal、SD/-Trp/-Ade/X-α-Gal和SD/-Leu/-Ade/X-α-Gal营养缺陷型平板上，以是否出现蓝斑判断自激活。将PrP的2个捕获载体AH109菌落接种到SD/-Leu/Amp(50μg/ml)液体培养基中，将Flotillins的10个诱饵载体AH109菌落接种到SD/-Trp/Kan(50μg/ml)培养基中，根据菌液生长浓度判断对AH109的毒性。采用PEG/LiAc小规模共转化法将上述捕获和诱饵载体两两组合分别转化AH109感受态，转化液涂在二缺培养基SD/-Leu/-Trp、三缺培养基SD/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal和四缺培养基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal上，进行培养和观察。将在四缺培养基上生长的蓝色菌落采用PCR法扩增目的基因、测序，并接种到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp液体培养基中培养，采用尿素/SDS法提取酵母总蛋白，以针对载体标签HA和Myc的单抗为检测抗体，进行Western-blots分析，判断共转化后AH109表达的蛋白是否为目标蛋白。上述实验同时以GAL4双杂交系统3的pCL1、pGBKT-53、pGADT7-T、pGBKT7和pGADT7为对照。成功构建了PrP25-241和PrP102-241捕获载体以及Flotillin-1及其八个缺失突变体和Flotillin-2的诱饵载体，这些重组载体对AH109没有毒性，对ADE2、HIS3和MEL1报告基因没有自激活性。共转化后，PrP25-241和Flotillin-1组合能够在四缺培养上生长，表明两者发生了强相互作用。PrP25-241和Flotillin-2组合只能在三缺培养上生长，两者发生了弱相互作用。PrP102-241与Flotillin-1和Flotillin-2不能够在三缺和四缺培养上生长，表明没有相互作用。PrP25-241与Flotillin-1的缺失突变体36-428aa,151-428aa,1-331aa和1-161aa的共转化液能够在四缺培养上生长，表明它们间发生了相互作用，而且分子效应区域在151-161aa。PCR扩增测序结果表明，发生相互作用蛋白的编码基因是正确的。Western-blots分析表明，在AH109酵母菌内发生相互作用蛋白为目的蛋白。通过构建缺失突变体和采用酵母双杂交法，确定了PrP25-241能够与Flotillin-1发生强相互作用，两者作用的分子区域位于进化上高度保守的磷酸化位点151-161氨基酸区段。本研究结果为设计能够阻断PrPc向PrPsc转化的靶药物提供了参考。