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目的 辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢／还原酶(NADP-dependent retinol dehydrogenase／reductase，NRDR)是黄东阳等于1997年在兔肝细胞中发现并纯化的一种新的催化视黄醇氧化／还原反应的脱氢酶，其参与维甲酸在体内的第一步代谢反应。NRDR对视黄醇有很高的底物特异性与亲和性，酶活性也远大于迄今所报道的乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)与细胞微粒体短链脱氢／还原酶(short-chain dehydrogenase／reductase，SDR)类，其活性在其它哺乳动物肝中也普遍存在，但以兔肝脏为最高。兔与小鼠的NRDR cDNA相近，全长约为1200bp，人的NRDR cDNA全长约为1300bp，三者编码区均为783bp，均编码260个氨基酸，已相继被克隆登录[AB045133][BC003484][AB04513 1]，但人肝脏NRDR尚未在蛋白水平鉴定活性。本研究通过克隆人肝组织中NRDR及其剪接体(sNRDR)全长cDNA，分析其核苷酸序列与氨基酸序列的结构特征，并进行蛋白表达，探讨NRDR及其剪接体(sNRDR)的生物学活性及催化反应特性，为研究肝脏中维甲酸代谢提供理论依据。 方法 1．NRDR cDNA克隆 提取人肝脏总RNA并进行纯度鉴定，逆转录合成肝脏cDNA，根据人、小鼠NRDR编码区的一致性序列，设计一对引物，使用Ominiscript Reverse Transcription Kit，分别扩增人与小鼠肝脏cDNA片段。回收扩增出的PCR片段进行PCR片段亚克隆，进行DNA序列分析。RACE法从人肝脏中扩增全长cDNA。采用TaKaRa公司3’ RACE试剂盒。首先，以试剂盒提供的Oligo dT-3sites Adaptor primer为引物进行逆转录；然后，根据测序结果设计F引物，R为试剂盒提供的3sites Adaptor primer，PCR扩增得到的产物克隆测序。采用TaKaRa公司5’ RACE试剂盒。首先，根据测序结果设计5’磷酸化RT引物进行逆转录；然后降解杂交RNA；接着进行连接反应，使cDNA环化或形成串联体;最后进行PCR反应，采用巢式PCR，设计两对引物，以此获得了5’末端片段，克隆后测序。采用NCBI Blast，Jell声sh，扬site等软件对获得的序列进行生物信息学分析，通过Geno3D蛋白质模建服务器进行三维结构模拟，得到的结果使用IMclite软件进行分析。应用RT一PCR和Northem的方法分别研究NRDR和sNRDR在胎儿和成人正常组织中的分布。 2.应用E.。011表达系统对NRDR进行表达 使用Gateway表达系统应用BUI一AI菌对获得的CDNA片段编码区进行表达。首先使用attB重组位点修饰编码区引物。然后将attB重组位点修饰的编码区与供体质粒pDONR201进行BP重组反应，构建带有NRDR编码区的Gateway系统入门载体(En仰clone)。扩增菌体，纯化质粒，将人门载体与E. coli表达载体进行LR重组反应。将NRDR编码区构建到pD-EST17载体中，以表达出氨基端6 x His一tag融合蛋白。将带有NRDR编码区的pDEsT17质粒转化Bul一AI菌，确定表达克隆，确定蛋白表达形式，确定蛋白表达时间，进行蛋白大量表达。分离表达出的包涵体，盐酸肌溶解变性，通过复性基质筛选确定最佳复性基质，使用Ni，‘树脂进行一步纯化和复性，咪哇梯度洗脱纯化蛋白。使用高效体积排阻色谱分析复性效率。纯化的蛋白与NADPH和视黄醛37℃孵育，5林C，8柱检测视黄醇的生成，测定纯化蛋白催化视黄醛还原反应活性。对检测出视黄醛还原反应催化活性蛋白使用双倒数法测定催化反应的KM值和Vmax值。 3.应用哺乳动物细胞蛋白表达系统对NRDR进行表达和功能分析 使用哺乳动物细胞Gateway蛋白表达系统对获得的。DNA片段编码区进行表达。首先使用attB重组位点修饰编码区引物，获得删除和不删除PISI定位信号的NRDR和sNRDR编码区片段。然后将attB重组位点修饰的编码区与供体质粒pDONR201进行BP重组反应，构建带有NRDR和sNRnR编码区的Gatew叮系统人门克隆(En仰elone)。扩增菌体，纯化质粒，将人门载体与哺乳动物细胞蛋白表达载体进行LR重组反应。将NRDR和sNRDR编码区构建到pDES犯6和pDES巧3载体中，以表达出N一端6xHis一tag融合蛋白和N一端GFP融合蛋白。应用阳离子转染试剂将pDES孔6重组质粒转染Hela细胞，进行Westem印迹分析检测蛋白表达。将转染后的细胞匀浆与NADpH和视黄醛37℃孵育，5林C，8柱检测视黄醇的生成，测定表达蛋白催化视黄醛还原反应活性。对pDEST53重组质粒转染后细胞进行过氧化氢酶免疫荧光染色和DAPI复染，使用荧光显微镜确定NRDR和sNRDR蛋白在细胞内的定位。结果 1.克隆NRDR及其剪切体的全长。DNA 经Blastu比较得知全长为1261bp的eDNA与GenBank登录的人过氧化物酶体的短链乙醇脱氢酶eDNA(peroxisomal short一ehain deohol dehydro-genase，SCAD一SRL，1258bp，BCoo3olg)几乎完全一致;与最初所报人NRDR的1325bp eDNA(AB045131)相比，编码区完全一致;而1003bp eDNA为一新的亚型序列，与126互bP oDNA相比在编码区缺少连续的258bp序列，其它完全一致，因此，我们将10O3bp eDNA以NADp一dependent retinol dehy枷-genase/reduetase short isoform(sNRDR)登录GenBank数据库(AY07 1856)。人NRDR的基因位于14号染色体长臂，整个基因序列为52638 bp，含有8个外显子和7个内含子。sNRDR是由