目的:锰是人体中必需微量元素之一,对于人体的健康必不可少,但人体长期过量锰暴露则会损害机体健康,导致锰的生殖毒性。锰在现代工业中用途广泛,研究人员发现过量锰暴露会产生生殖毒性导致雄性生殖系统功能障碍。N~6-甲基腺苷（N~6-Methyladenosine,m~6A）是一个动态可逆的调节过程,作为一种内部修饰其在真核m RNA中最为丰富。研究表明m~6A修饰在精原细胞的分化、增殖及精子形成中发挥重要作用。YTH功能结构域家族蛋白能够与m~6A修饰序列结合,其中含YTH域蛋白2（YTH domain-containing protein 2）YTHDC2在生育方面发挥着重要作用,研究证明在雄性小鼠敲除YTHDC2后其睾丸和附睾表现出缩小的情况并且无法正常生成精子。细胞周期是一个复杂的过程,细胞周期蛋白D2（Cyclin D2,CCND2）可以控制细胞的G1期正常过渡到S期,这对于生殖细胞的增殖、分化和凋亡是必需的。本研究拟利用动物体内实验的方法探明雄性小鼠锰暴露对睾丸及其生殖细胞的影响,探明YTHDC2调控CCND2在细胞周期异常中所发挥的作用,最终揭示锰暴露导致精子发生障碍的机制。研究方法:选用196只3周龄野生型C57BL/6雄性小鼠将其按实验阶段分为两部分。第一阶段为小鼠的单纯锰暴露,暴露方式为灌胃,将56只小鼠按体重随机分为4组。第1组为对照组,给予超纯水;第2-4组按照14、28、56 mg/kg梯度剂量给予氯化锰（溶于超纯水）,以低、中、高剂量氯化锰染毒组命名。第二阶段为回复实验,将140只小鼠按体重随机分为10组,,每组14只。分别为对照组、超纯水+空载腺病毒组（ADV-NC）、超纯水+过表达YTHDC2腺病毒组（ADV-YTHDC2）、超纯水+CCND2抑制剂组（IN-CCND2）、超纯水+过表达YTHDC2腺病毒+CCND2抑制剂组（ADV-YTHDC2+IN-CCND2）、给予高剂量氯化锰组（Mn）、氯化锰+空载腺病毒组（Mn+ADV-NC）、氯化锰+过表达YTHDC2腺病毒组（Mn+ADV-YTHDC2）、氯化锰+CCND2抑制剂组（Mn+IN-CCND2）、氯化锰+过表达YTHDC2腺病毒+CCND2抑制剂组（Mn+ADV-YTHDC2+IN-CCND2）。每7天记录一次体重。连续染毒35天,染毒结束后立即取材。将每组小鼠分为两部分,第一部分共6只小鼠,分离附睾组织制成精子悬液用于精子计数和形态的观察。第二部分共8只小鼠,在饲养小鼠第1周、第3周和第5周进行睾丸多普勒超声检测睾丸形态变化,每组取6只小鼠,分离睾丸及附睾组织称重并提取蛋白质和m RNA。每组另取2只,用睾丸固定液灌流固定后,石蜡包埋切片进行HE染色和糖原染色观察组织结构改变。结果:第一部分:锰暴露对小鼠睾丸的影响。1.体内实验发现第35天,各锰暴露剂量组的小鼠体重较对照组相比差异不明显,但各组小鼠体重随时间明显增加。2.锰暴露组小鼠附睾内精子数量、精子活力降低。3.锰暴露小鼠附睾内精子畸形率显著升高。4.锰暴露组小鼠睾丸发育迟缓且第5周睾丸超声体积以及睾丸组织的脏器系数与对照组相比显著降低,然而小鼠附睾脏器系数差异不明显。5.HE染色结果和糖原染色结果发现,锰暴露会造成睾丸组织损伤,导致生殖细胞数量减少。随着暴露剂量的增加,其睾丸组织损伤逐渐加重。与对照组相比,低、中、高剂量染毒组小鼠睾丸出现巨噬细胞和生殖细胞碎片脱落迹象以及表现出了曲细精管萎缩。6.染毒阶段YTHDC2的m RNA表达和蛋白水平受到锰暴露的影响,下降明显。其中56mg/kg锰暴露组YTHDC2 m RNA表达及蛋白水平下降较明显。7.精原细胞分化的标志物KIT、减数分裂启动的标志物STRA8与减数分裂联会标志物SYCP3的荧光强度随着锰暴露剂量的增加而降低。第二部分:YTHDC2在锰暴露对小鼠睾丸影响中的作用。1.构建YTHDC2过表达动物模型成功后,Mn+ADV-YTHDC2组精子数目与Mn+ADV-NC组相比,精子数量明显增多,精子活力与精子数量相似。2.Mn+ADV-YTHDC2组精子畸形率较Mn+ADV-NC组相比显著降低。3.在第5周Mn+ADV-NC组以及Mn+ADV-YTHDC2的睾丸超声体积在第3周和第5周均比ADV-NC组小,睾丸发育更加缓慢。睾丸脏器系数与第5周睾丸超声体积结果相似。4.Mn+ADV-YTHDC2组的SYCP3的荧光强度与Mn+ADV-NC组相比明显增强,STRA8与SYCP3相似。第三部分:CCND2在锰暴露对小鼠睾丸影响中的作用。1.CCND2的m RNA表达和蛋白水平受到锰暴露的影响,下降明显。其中56 mg/kg锰暴露组CCND2 m RNA表达及蛋白水平下降最为明显。在YTHDC2过表达后,Mn+ADV-YTHDC2组CCND2的蛋白及m RNA表达水平与Mn+ADV-NC组相比呈明显回升。在抑制CCND2后,对照组的CCND2蛋白及m RNA表达水平下降,但过表达YTHDC2后,ADV-YTHDC2+IN-CCND2组的CCND2表达与IN-CCND2组相比,显著升高。2.IN-CCND2组的精子数量及精子活力与对照组相比明显下降,高锰组给予CCND2抑制剂情况与对照组相似。3.IN-CCND2组的精子畸形率与对照组相比明显增加,经过YTHDC2过表达,精子畸形率减小。4.IN-CCND2组的KIT、STRA8以及SYCP3的荧光强度相较对照组明显降低,ADV-YTHDC2+IN-CCND2组STRA8和SYCP3的荧光强度较IN-CCND2组增高。Mn+ADV-YTHDC2+IN-CCND组SYCP3与Mn+IN-CCND2组相比荧光回复明显。第四部分:YTHDC2、CCND2在锰暴露对小鼠睾丸组织影响中的作用。1.Mn+ADV-YTHDC2组与Mn+ADV-NC组相比,生殖细胞数目增多。IN-CCND2与对照组相比生殖细胞略少。Mn+ADV-YTHDC2组与高锰组相比,虽然曲细精管萎缩程度差不多,但脱落的生殖细胞碎片明显减少,而Mn+IN-CCND2组生殖细胞明显减少,但在过表达YTHDC2后,生殖细胞数目增多。2.糖原染色结果与HE染色结果相似,但其对精子顶体的染色效果较好,Mn+ADV-YTHDC2组与Mn+ADV-NC组相比,不仅生殖细胞数目增多,锰暴露导致的精子丢失在YTHDC2过表达后精子再次出现。IN-CCND2组的生殖细胞和精子数量与对照组相比均减少,过表达YTHDC2后,ADV-YTHDC2+IN-CCND2的生殖细胞及精子呈现增多的迹象。结论:1.过量锰暴露会使雄性小鼠睾丸组织损伤,并影响小鼠的精子质量。2.锰可以降低小鼠睾丸中的YTHDC2以及CCND2的表达,并且可通过降低睾丸中的YTHDC2表达进而减低CCND2水平,从而干扰生殖细胞正常周期导致精子发生异常。