细胞信号转导的调节方式多种多样，可逆的蛋白酪氨酸磷酸化是其关键的调节方式之一。其蛋白酪氨酸的磷酸化及去磷酸化分别在蛋白酪氨酸激酶PTK和蛋白酪氨酸磷酸酶PTP的作用下，被磷酸化、被去磷酸化。保持其磷酸化水平的动态平衡。这些过程也影响很多生理活动，诸如基因表达、细胞生长、细胞分化、细胞通讯、细胞迁移、血糖代谢调节、免疫调节等。蛋白酪氨酸磷酸酶的催化功能异常，会影响蛋白酪氨酸磷酸化水平的相对稳定。也是导致很多疾病诸如Ⅰ型糖尿病、系统性红斑狼疮、风湿性关节炎疾病的重要原因之一。因此蛋白酪氨酸磷酸酶也引起了科学界很大的研究兴趣，特别与疾病密切相关的淋巴特异的蛋白酪氨酸磷酸酶-LYP.LYP由PTPN22编码，特异表达于淋巴组织和细胞中。在淋巴T细胞中通过抑制T细胞活化，作用于T细胞受体-TCR发挥作用。许多研究发现LYP的突变与很多自身免疫性疾病密切相关。尤其是bottini等人首次报道的编码LYP的基因单核苷多态性C1858T人群更容易患Ⅰ性糖尿病。此突变导致氨基酸突变由620位的精氨酸突变为色氨酸。此突变影响了LYP与CSK的相互作用。此突变的细胞实验表明R620W的酶活更强，去磷酸化下游分子的水平更强，对免疫效应有更强的抑制作用。因此LYP已经逐渐成为治疗多种自身免疫性疾病的潜在的药物靶点。针对此药物靶点，发现特异作用于LYP的小分子化合物抑制剂便具有重大的意义。LYP作为经典的蛋白酪氨酸家族中的一员，此家族酶的活性中心具有结构上的高度保守性，因此罕有选择性抑制剂被开发出来。过去，一些典型的蛋白酪氨酸磷酸酶，包括PTP1B、LYP的选择性抑制剂，通过作用于磷酸化的酪氨酸结合口袋，及其附近区域被开发出来。最近，作为另外一种抑制方式，一些与疾病相关的蛋白酪氨酸磷酸酶，包括PTP1B、SHP2的非竞争抑制剂被开发出来。但LYP的非竞争性抑制剂至今未被发现。　　目的：　　筛选LYP的别构调节小分子抑制剂，并揭示抑制剂别构抑制的作用机制。　　方法：　　首先，我们构建了一系列LYP原核表达质粒，转化到E.coli BL21工程菌中表达蛋白，并通过离子交换层析和分子筛实验获得高纯度的蛋白。体外生化手段-进行抑制剂半数抑制效率IC50测定，筛选作用较好的抑制剂，进行抑制模式检测，并进行抑制剂抑制常数Ki的测定，拟合米氏方程发现NC1抑制剂符合非竞争性抑制模式。之后我们进行PTP家族范围内，进行抑制剂选择性检测，以小分子化合物对硝基苯磷酸二钠为模拟底物，分别检测了抑制剂对磷酸酶STEP、PTPN18、Glepp、slingshot2、PPM1A、PPM1G、PP1的抑制作用，测出抑制常数，进行选择性评估。进一步，我们在细胞水平上，通过siRNA技术特异干扰LYP的表达，通过Western blot检测LYP调控通路中，LCK、ERK分子的磷酸化水平，检测NC1在细胞中特异抑制LYP的作用，及其抑制效果。之后通过对LYP催化结构域进行单位点突变，测定抑制剂抑制常数Ki指标;基于片段中心的拓扑学口袋分析、分子动态模拟方法，研究抑制剂NC1的作用位点。此外，我们运用了一种新技术，利用非天然氨基酸二氟代酪氨酸(F2Y)的插入、19F-NMR方法研究NC1的别构调节作用机制。　　结果：　　我们发现了LYP的第一个非竞争性抑制剂NC1，其抑制常数Ki为4.66μM，具有较高的抑制作用。在NC1抑制剂选择性的测定中，针对于PTP家族的成员，包括STEP，PTPN18，Glepp，and the Ser/Thr phosphatases PPM1A and PP1，NC1表现出至少两倍以上的选择性，对于LYP具有较好的特异性。细胞实验，通过使用anti-CD3激活TCR信号通路，Western blot结果显示LCK、ERK的磷酸化水平增强，这种磷酸化水平的增强在进行NC1孵育后更加明显。利用RNAi技术干扰Jurkat T细胞中的LYP，结果显示LCK、ERK的磷酸化水平增强与单独使用NC1时磷酸化程度相同，甚至，当干扰掉LYP之后，NC1便不再发挥作用，其LCK、ERK的磷酸化水平与对照组相同。进而表明NC1在淋巴细胞中也能够特异高效地抑制LYP。通过点突变、基于片段中心的拓扑学口袋分析、分子动力学模拟的方法显示NC1并不同于其他已知的LYP抑制剂，同时作用于WPD口袋，以及LYP特异插入片段附近的次级口袋。用我们新开展的技术-非天然氨基酸二氟代酪氨酸(F2Y)插入及19F-NMR技术，我们提供了一个直接的证据，揭示了NC1通过抑制LYP-WPD loop的运动来别构调节LYP酶活的机制。　　结论：　　NC1不同于其他的LYP抑制剂，它是一种非竞争性抑制剂，它同时作用于WPD结构域、以及处于LYP特异插入片段周围的二级口袋区，并通过限制LYP的WPD-loop的运动来别构调节LYP的活性。　　意义：　　我们的此项研究不仅仅是发现了LYP特异的别构抑制剂NC1，而且为将来设计选择性更好的抑制剂提供了别构结合位点，此外将新技术非天然氨基酸插入，19F-NMR;应用其中，提供了新颖的19F-NMR探针，可以用于发现其他的酪氨酸磷酸酶的别构抑制剂。