背景恶性肿瘤已经成为严重影响人类生存与健康的第一因素,而胃癌因其临床症状隐匿、检测手段单一、临床治疗方法疗效甚微等一系列因素的制约,致死率在消化系统肿瘤中居于前列。因此胃癌的早期诊断对胃癌诊断与治疗是十分重要的,而内镜技术在其中的地位不言而喻。随着胃镜技术的发展,出现了先进电子染色内镜技术,目前临床使用的荧光探针材料一般为Proflavine(一种吸收波长为445nm、发射波长为515nm的细胞核染料),这种染料存在生物体毒性、穿透深度有限、精确度灵敏度一般的缺点。随着纳米技术的发展,纳米材料与生物医学相结合的潜在发展成为热点。而在这其中稀土上转换发光纳米材料(upconversion nanoparticles,UCNPs)格外引人关注。1999年,有研究小组首次开展了UCNPs在分子探针领域的研究,并报道UCNPs在DNA芯片荧光检测中作为标记物的作用,并且其检测灵敏度是荧光染料Cy5的3倍。随后,研究人员开展了一系列利用稀土上转换发光探针进行生物荧光检测的研究。与常用的生物荧光标记材料相比,UCNPs具有一系列优点,例如光、化学性质稳定,大的斯托克斯位移,相对窄的吸收和发射频带,使用寿命长,生物毒性低等。另外传统的紫外线激发源有非特异性荧光影响大,穿透深度小,长时照射对生物细胞损伤大等缺点,而近红外光作为UCNPs激发光源,有穿透深度大,非特异性荧光影响小,对生物组织几乎无损伤等与紫外线激发源差异明显的优点。此外,从激发光源角度讲稀土上转换发光只需要低功率密度的近红外连续激光器(980nm),相对于高功率密度的脉冲双光子激光激发产生的上转换发光,经济普适性更佳。UCNPs以上陈述的优点成为研究的焦点,主要集中在标志物成像,免疫分析和光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)等领域。但是传统的UCNPs存在水溶性不佳、粒子直径过大、细胞内聚集过少、荧光过弱等缺点,本研究旨在合成一种水溶性UCNPs并对它的细胞成像、细胞毒性加以探讨。水热法合成以聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)作为表面配体的Na YF4∶20%Yb3+,3%Er3+的UCNPs,并完成对它物理性质、光学性质的鉴定。运用光学显微镜成像技术来完成UCNPs的成像,鉴定UCNPs的成像能力,再通过MTT法、LDH逸出法检测UCNPs的细胞毒性。通过MTT法、LDH逸出法对UCNPs细胞毒性的检测可以得出以下结论:400μg/m L的UCNPs对SGC-7901细胞有明显的细胞毒性,并且与GES-1细胞相比,SGC-7901细胞活性下降更加明显,对UCNPs更加敏感。活性氧(reactive oxidative species,ROS)在介导细胞死亡和肿瘤细胞敏感差异性方面发挥重要作用,因此UCNPs引发细胞活性下降的原因有可能与UCNPs引发细胞质内ROS水平升高有关,并在ROS诱导下引发细胞死亡。细胞的死亡方式主要包括细胞坏死和细胞凋亡,细胞凋亡又主要分为外源性凋亡和内源性凋亡。线粒体在内源性途径中起到核心作用,线粒体膜电位(ΔΨm)代表了线粒体的活性,通常将ΔΨm的降低作为细胞早期凋亡的信号,ΔΨm的降低标志着细胞凋亡进入了不可逆的阶段。ΔΨm的降低与细胞质Ca2+的升高相关,而且ΔΨm的崩溃与Cyt C的释放有着重要的联系。相关蛋白中Bax有促进Cyt C释放的作用,Bcl-2则相反。Cyt C被释放后与APaf-1结合,继而激活pro Caspase-9,进一步剪切Caspase-3,Caspase-3被激活后则引起一系列酶、蛋白、DNA的破坏,从而最终导致细胞凋亡。线粒体凋亡路径与细胞质中ROS的浓度密切相关,肿瘤细胞对高水平的ROS十分敏感,在高水平ROS影响下肿瘤细胞活性会大幅降低甚至死亡,并且高水平ROS会作为第二信使诱导线粒体凋亡路径发生。PI3K-Akt信号通路在维持细胞数目相对动态平衡中的作用十分重要,而且该通路在肿瘤细胞无限增殖、侵袭转移等特性以及在肿瘤细胞常规治疗中削弱放化疗对肿瘤细胞的效应中起着重要作用。方法1.水热法合成以PVP作为表面配体的Na YF4∶20%Yb3+,3%Er3+的UCNPs,并运用SEM完成对UCNPs粒径、形貌的鉴定。2.运用XRD完成对UCNPs结构的鉴定。3.荧光光谱鉴定在980nm近红外光激发下UCNPs的光学性质。4.光学显微镜成像技术手段来完成UCNPs对离体SGC-7901细胞的荧光成像。5.通过MTT法、LDH逸出法完成对UCNPs细胞毒性的检测。6.Annexin V-FITC流式检测和细胞周期流式检测来评估UCNPs诱发细胞死亡的方式。7.DCFH-DA流式检测UCNPs作用SGC-7901细胞内ROS水平的变化。8.为了进一步探明ROS引发细胞凋亡的可能机制与影响因素,相继流式检测了ΔΨm、胞质内Ca2+,酶标仪检测Caspase-9、Caspase-3吸光度,Western blot检测Cyt C、Bax、Bcl-2、Akt、p Akt(Ser473)在UCNPs作用SGC-7901细胞24h后的表达。结果1.通过分析水热法合成以PVP作为表面配体的Na YF4∶20%Yb3+,3%Er3+UCNPs的SEM照片,可以看出该方法合成的是粒径为30nm的球形粒子,粒径均一。2.将UCNPs进行了XRD衍射图谱表征,证明利用该方法合成的纳米粒子是纯立方相结构。3.分析纳米粒子的荧光光谱得知其中UCNPs主要具有峰位在540nm绿光和650nm红光的两个发光峰。4.UCNPs的成像作用从明场检测图像看出,吞噬纳米粒子的细胞形态、数目无明显变化,细胞与可与一定范围浓度(200μg/m L)内的纳米粒子共存。吞噬纳米粒子的活体细胞的暗场图像图,显示纳米粒子的荧光成像能力,纳米粒子在细胞中均匀分布,经波长为980nm的激光激发后显现明亮黄色。5.细胞毒性检测显示,MTT结果显示三种细胞(Hela细胞、GES-1细胞、SGC-7901细胞)死亡率随着纳米粒子浓度的增加而增加,当纳米粒子浓度增大至400μg/m L时,作用24h后,细胞活性降至最低值,Hela细胞降幅较之相应对照组0μg/m L达到22.13%,GES-1细胞30.08%,SGC-7901细胞36.13%。并且细胞毒性与作用时间正相关,纳米粒子对SGC-7901细胞的细胞毒性最明显,当浓度为400μg/m L,作用时间72h,细胞死亡率达到65.72%。LDH逸出实验显示SGC-7901细胞的LDH释放率与纳米粒子浓度、作用时间正相关,浓度400μg/m L,作用时间24h时,SGC-7901 LDH释放率较之对照组0μg/m L增幅36.21%。6.Annexin V-FITC细胞凋亡检测和细胞周期检测纳米粒子抑制细胞增殖的主要方式是细胞凋亡(正常细胞降幅17.4%,晚期凋亡及坏死细胞增幅10.1%,早期凋亡细胞增幅6%)和阻滞细胞周期(G1期)。7.DCFH-DA检测表明纳米粒子作用后SGC-7901细胞ROS水平明显升高,当纳米粒子浓度增加至400μg/m L时达到峰值,增幅71.43%。8.ROS的爆发引发一系列分子水平改变,当纳米粒子浓度增大至400μg/m L时,SGC-7901胞质内Ca2+涨幅71.43%,ΔΨm降幅152.38%,继而加速Cyt C的释放,增幅40.35%,Bax上调130.21%及Bcl-2下调48.75%,Caspase-9、Caspase-3释放增加,增幅各170.39%、50.15%,引发细胞凋亡。该过程同时引发p Akt(Ser473)的下调,降幅46.17%。结论1.UCNPs尺寸30nm,性质稳定。2.UCNPs易于被SGC-7901细胞摄取,光学显微镜下可见SGC-7901细胞内较强的黄色荧光,显示了一定浓度范围内UCNPs(200μg/m L)具备良好的细胞膜穿透性,稳定的荧光成像能力。3.通过MTT、LDH逸出法等不同检测方法,证明UCNPs在200μg/m L浓度范围内有良好的生物安全性。4.当UCNPs浓度增加至400μg/m L时,有明显的细胞毒性,并且诱导细胞死亡方式主要是阻滞细胞周期及诱发细胞凋亡,主要诱因是引发细胞质内ROS的升高导致线粒体凋亡途径激活,该途径同时受到PI3K-Akt信号通路介导。