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目的在传统经典的理论分类中，糖尿病视网膜病变属于微血管病变，但是，在实际上，它也是一种视网膜的神经变性类疾病。在对人类和实验动物的研究中，许多的数据均表明，糖尿病发病后不久，在糖尿病血管并发症出现之前，神经元内的分子功能就已经发生了变化。糖尿病中视网膜的神经病变早于糖尿病血管并发症出现，并贯穿糖尿病的始终，严重危害糖尿病病人的视力。神经营养因子是一种促进神经元存活、促进其形态发展及生理功能分化的蛋白质。许多研究结果都表明，在神经营养因子中，脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor，BDNF）在视网膜的生理和病理生理过程中具有重要作用。BDNF在视网膜神经节细胞层（retinal ganglion cells，RGCs）和Müller纤维中表达，并且对神经节细胞的生存起重要作用。有报道认为BDNF可以阻止无长突细胞的死亡，BDNF可以调节突触的作用，还可以导致大鼠视网膜中多巴胺能细胞的肥大。多巴胺在人体中发挥着多种多样重要且复杂的作用，涉及细胞的生长、发育、死亡等各个方面。在眼内组织中，多巴胺在日节律、细胞存活和眼的生长发育方面也具有复杂的营养作用。在哺乳动物的视网膜，多巴胺能无长突细胞体位于内核层（inner nuclear layer，INL）和内网状层（inner plexiform layer，IPL）的交界处，多巴胺由多巴胺能无长突细胞上的一种特殊的装置所释放，并激活分布于视网膜上的D1和D2多巴胺受体而发挥作用。多巴胺能神经元在发育的早期出现，在动物视觉发生之前就具有功能，并在动物老化过程中开始死亡。一些疾病能够影响到其功能，并减弱多巴胺的释放和循环。多巴胺合成的限速酶是酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH），在多巴胺能无长突细胞中，TH和多巴胺一样，都分布于整个细胞，包括最为精细的突起和末稍。在糖尿病的早期，视网膜电图中最突出的变化见于视网膜振荡电位的改变，而此振荡电位就发源于视网膜多巴胺能无长突细胞。此外，通过对TH的免疫活性检测发现，在糖尿病鼠视网膜，多巴胺能无长突细胞发生变性。TH的蛋白质水平与对照组相比有所降低，这反映了多巴胺能无长突细胞的密度和TH免疫活性浓度的下降。因此，我们认为多巴胺能系统的变化是糖尿病视网膜病变发生发展中最为重要的事件之一。本文拟在mRNA水平和蛋白质水平探讨在糖尿病早期，Wistar大鼠视网膜中BDNF水平的变化，并且在糖尿病大鼠玻璃体腔内注射BDNF之前与注射之后、在糖尿病大鼠玻璃体腔内注射腺病毒介导的BDNF之前与注射之后，Wistar大鼠视网膜中TH的水平及多巴胺能无长突细胞数目的变化，旨在初步探讨在糖尿病的早期视网膜神经病变的发病机制。为临床上治疗糖尿病视网膜病变及BDNF的眼内应用提供实验依据。方法1．选用9周龄Wistar大鼠，体重180～220g之间，以链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔注射，制成糖尿病模型，于糖尿病模型建立的4周后处死大鼠，取出眼球，取视网膜切片进行BDNF原位杂交检测，观察糖尿病早期大鼠视网膜中BDNFmRNA水平的变化。取视网膜组织匀浆，夹心法ELISA检测大鼠视网膜中BDNF的蛋白质水平。2．于大鼠糖尿病模型建立的2周后，向大鼠眼玻璃体腔内注射BDNF溶液，每3天注射一次，共注射5次。于模型建立的4周后，处死大鼠，取出眼球，取视网膜组织进行Western blotting及视网膜铺片免疫组织化学染色检测，观察大鼠视网膜中TH水平的变化，从而反映糖尿病大鼠视网膜中多巴胺能无长突细胞水平的变化。3．于大鼠糖尿病模型建立的2周后，向大鼠眼玻璃体腔内注射含有BDNF基因的五型重组腺病毒（Ad.BDNF），于模型建立的4周后，处死大鼠，取出眼球，取视网膜组织进行Western blotting及视网膜铺片免疫组织化学染色检测，观察大鼠视网膜中TH水平的变化，从而反映糖尿病大鼠视网膜中多巴胺能无长突细胞水平的变化。结果1．大鼠视网膜组织切片的原位杂交结果可见，实验组糖尿病大鼠视网膜中BDNF阳性细胞计数降低，与对照组相比有统计学差异；实验组糖尿病大鼠视网膜中BDNF阳性细胞的染色灰度值亦降低，与对照组相比有统计学差异。Wistar大鼠视网膜组织匀浆ELISA测定结果可见，实验组糖尿病大鼠视网膜中BDNF蛋白质水平降低，与对照组相比较有统计学差异。2．大鼠视网膜组织匀浆Western blotting测定结果可见，在实验组中，糖尿病大鼠玻璃体腔内未注射BDNF眼大鼠视网膜中TH蛋白水平降低，与对照组相比，有统计学差异。大鼠视网膜铺片免疫组织化学染色结果可见，多巴胺能无长突细胞计数及灰度值亦降低，与对照组相比，有统计学差异。实验组糖尿病大鼠注射BDNF眼视网膜中TH蛋白水平、多巴胺能无长突细胞计数及灰度值与对照组无统计学差异。3．大鼠视网膜组织匀浆Western blotting测定结果可见，在实验组中，糖尿病大鼠玻璃体腔内未注射Ad.BDNF眼视网膜中TH蛋白水平降低，与对照组相比，有统计学差异。大鼠视网膜铺片免疫组织化学染色结果可见，多巴胺能无长突细胞计数及灰度值亦降低，与对照组相比，有统计学差异。实验组糖尿病大鼠注射Ad.BDNF眼视网膜中TH蛋白水平、多巴胺能无长突细胞计数及灰度值与对照组无统计学差异。结论1．在糖尿病早期大鼠视网膜中BDNF蛋白水平及BDNF mRNA水平降低。2．在STZ糖尿病大鼠糖尿病早期，视网膜中TH蛋白水平及多巴胺能无长突细胞的数目降低。3．在STZ糖尿病大鼠糖尿病早期，玻璃体腔内注射BDNF可提高视网膜中TH的水平及多巴胺能无长突细胞的数目。4．在STZ糖尿病大鼠糖尿病早期，玻璃体腔内注射Ad.BDNF可提高视网膜中TH的水平及多巴胺能无长突细胞的数目。